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Dec 03, 2023

Ökophysiologie und Genomik der an Brackwasser angepassten SAR11-Subklasse IIIa

Das ISME Journal Band 17,

The ISME Journal Band 17, Seiten 620–629 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Ordnung Pelagibacterales (SAR11) ist die am häufigsten vorkommende Gruppe heterotrophen Bakterioplanktons in den globalen Ozeanen und umfasst mehrere Unterklassen mit einzigartigen räumlich-zeitlichen Verteilungen. Unterklasse IIIa ist die primäre SAR11-Gruppe in Brackwasser und hat einen gemeinsamen Vorfahren mit der dominanten Süßwasser-Unterklasse IIIb (LD12). Trotz seiner Dominanz in Brackwasserumgebungen mangelt es der Subklasse IIIa an systematischen genomischen oder ökologischen Studien. Hier kombinieren wir geschlossene Genome aus neuen IIIa-Isolaten, neuen IIIa-MAGS aus der San Francisco Bay (SFB) und 460 hochvollständigen öffentlich verfügbaren SAR11-Genomen für die bisher umfassendste pangenomische Studie der Subklasse IIIa. Unterklasse IIIa stellt eine taxonomische Familie dar, die drei Gattungen (bezeichnet als Untergruppen IIIa.1, IIIa.2 und IIIa.3) enthält, die unterschiedliche ökologische Verteilungen im Zusammenhang mit dem Salzgehalt aufwiesen. Die Ausweitung der Taxonauswahl innerhalb der Subklasse IIIa führte auch zu einer zuvor festgestellten metabolischen Differenzierung in der Subklasse IIIa im Vergleich zu anderen SAR11-Subklassen wie Glycin/Serin-Prototrophie, Vorhandensein von Mosaik-Glyoxylat-Shunts und Polyhydroxyalkanoat-Synthesepotenzial. Unsere Analyse zeigt außerdem die metabolische Flexibilität zwischen Untergruppen innerhalb von IIIa. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Unterklasse IIIa.3 aufgrund ihres Potenzials für kompatiblen Transport gelöster Stoffe, Eisenverwertung und Bikarbonatmanagement eine Brücke zwischen den Meeres- und Süßwassergruppen schlägt. Reinkulturexperimente validierten unterschiedliche Salzgehaltsbereiche in IIIa.1 und IIIa.3 und lieferten detaillierte IIIa-Zellgrößen- und -volumendaten. Diese Studie ist ein wichtiger Fortschritt für das Verständnis der genomischen, ökologischen und physiologischen Differenzierung der Subklasse IIIa und der gesamten Evolutionsgeschichte von SAR11.

Die SAR11-Klade (Pelagibacterales) ist eine vielfältige Ordnung von Bakterioplankton, die bis zu 40 % der heterotrophen Bakterien in globalen Oberflächenmeeren ausmacht [1, 2]. Die Gruppe umfasst mehrere Unterklassen, die einzigartige räumlich-zeitliche Verteilungen in globalen Gewässern aufweisen, die der phylogenetischen Struktur der Gruppe entsprechen [1, 3]. Vieles von dem, was über SAR11 bekannt ist, stammt aus der Unterklasse Ia, einschließlich der gut charakterisierten Stämme HTCC1062 und HTCC7211 [4,5,6]. Studien, die sich auf diese Organismen und andere Genome innerhalb von Ia konzentrierten, definierten SAR11 als kanonische genomoptimierte oligotrophe marine Heterotrophe [7,8,9] mit spezifischen Nährstoffanforderungen [10], einfachen Regulierungssystemen [7, 11, 12] und Auxotrophien für wichtige Aminogruppen Säuren und Vitamine [13, 14], Aufteilung des Kohlenstoffflusses zur Assimilation oder Energie basierend auf externen Nährstoffkonzentrationen [15] und Empfindlichkeit gegenüber reinigender Selektion innerhalb eng verwandter Populationen [16]. Studien an Nicht-Ia-SAR11-Subklassen haben Hinweise auf zusätzliche subklassenspezifische genomische Anpassungen und Biogeographie geliefert. Beispielsweise enthält die Subklasse Ic subtile genomische Veränderungen wie die Aminosäurezusammensetzung, eine erhöhte intergenische Spacergröße und Gene, die für Zellwandkomponenten kodieren, als wahrscheinliche Anpassungen an das Bathypelagic [17]. Einige Mitglieder der Unterklassen II und Ic besaßen Gene für die Nitratreduktion in Sauerstoffminimumzonen, was den ersten Beweis für einen fakultativen anaeroben Stoffwechsel in SAR11 lieferte [18]. Die Süßwasser-Subklasse LD12/IIIb wurde kürzlich kultiviert und ihr Wachstum bei niedrigen Bracksalzgehalten und der Verlust von Osmoregulationsgenen liefern eine Hypothese für die Anpassung von SAR11 an Süßwasserökosysteme [19, 20].

Eine weitere wichtige SAR11-Unterklasse, IIIa, die einen jüngsten gemeinsamen Vorfahren mit der Süßwassergruppe LD12/IIIb hat [3, 19] (im Folgenden LD12), hat vergleichsweise wenig Aufmerksamkeit erhalten, obwohl sie eine Schlüsselgruppe für die Untersuchung des evolutionären Übergangs von SAR11 aus dem Meer darstellt zu Süßwasser. Bisher gibt es nur zwei gemeldete Isolate, HIMB114 (isoliert von der Küste von Oahu, Hawaii [8]) und IMCC9063 (isoliert von der Küste von Spitzbergen, Norwegen [21]), aber dieser Mangel an systematischen Studien ist kein Hinweis auf die Relevanz von IIIa in globalen aquatischen Systemen. IIIa ist die am häufigsten vorkommende SAR11-Subklasse in Brackwasser und ihre Verbreitung variiert je nach Salzgehalt und phylogenetischer Position, wobei zwei Primärzweige durch die beiden Isolate und ihre Genome repräsentiert werden (22, 23). In einer Untersuchung der Ostsee war der IMCC9063-Typ von SAR11 der häufiger vorkommende Vertreter in Brackwasser (Salzgehalt < 10), während der HIMB114-Typ seinen Höhepunkt in stark brackigem bis marinem Salzgehalt erreichte [22]. Ein ähnlicher Trend wurde auch in den Flussmündungen des nördlichen Golfs von Mexiko beobachtet, in denen mehrere operative taxonomische Einheiten (OTUs) von SAR11 IIIa ökologisch durch Salzgehalte über und unter ~10 getrennt waren [23]. In der San Francisco Bay (SFB) ergab eine OTU-basierte Studie zum 16S-rRNA-Gen-Amplikon auch, dass Subklasse IIIa bei mesohalinen Salzgehalten dominiert [24]. Darüber hinaus waren die beiden etablierten Zweige von IIIa durch Temperatur und Breitengrad in polaren und gemäßigten Gewässern getrennt [25]. Trotz Hinweisen auf eine Nischentrennung aufgrund ihrer Umweltverteilung wurden die Temperatur- und Salzgehaltstoleranzen dieser Organismen nicht experimentell getestet.

Im Vergleich zu anderen SAR11-Genen gibt es vergleichsweise wenig Informationen über Subklasse IIIa, und aus Studien mit vergleichender Genomik konnten bisher nur begrenzte Informationen gewonnen werden. Keiner der IIIa-Vertreter enthält einen vollständigen glykolytischen Weg, obwohl die benachbarte Unterklasse LD12 einen typischen EMP-Weg enthält [19] und einige Vertreter der Unterklasse I eine Variante des ED-Wegs haben [26]. Während alle SAR11-Mitglieder auf exogenen reduzierten Schwefel angewiesen sind, verfügen weder HIMB114 noch IMCC9063 über das genomische Potenzial, DMSO oder DMSP wie andere SAR11-Stämme zu verwenden [15, 27, 28, 29]. Der umfangreiche C1-Metabolismus, der in anderen SAR11-Stämmen zu finden ist, fehlt auch in IIIa-Genomen [17]. Im Gegensatz zu anderen gut untersuchten SAR11-Mitgliedern wurde berichtet, dass HIMB114 und IMCC9063 serABC für die Glycin/Serin-Prototrophie enthalten, und IMCC9063 enthält auch ein tenA-Homolog, das in Subklasse I nicht gefunden wird, was es ermöglichen könnte, dass AmMP anstelle von HMP als Thiaminquelle dient [ 14]. Zusammengenommen legen diese genomischen Vorhersagen nahe, dass sich IIIa in einigen Aspekten des Stoffwechselpotenzials grundlegend von anderen gut untersuchten SAR11-Kladen unterscheidet, was mit dem allgemeinen SAR11-Trend der Phylogenie übereinstimmt, der die einzigartige Ökologie und genomische Neuheit bestimmter Kladen widerspiegelt. Darüber hinaus weisen das 16S-rRNA-Gen und die phylogenomischen Bäume auf mindestens drei separate IIIa-Untergruppen statt nur auf zwei hin, was Fragen zu einer möglichen zusätzlichen genomischen und ökologischen Diversifizierung innerhalb von IIIa aufwirft [3, 30].

Um unser Verständnis der genomischen, ökologischen und physiologischen Variation in der SAR11-Subklasse IIIa zu verbessern, führten wir eine umfassende Studie durch, bei der wir neue Isolate, drei geschlossene Genome dieser Stämme und weitere 468 SAR11-Genome nutzten, die neue und öffentlich verfügbare Metagenome enthielten Genome (MAGs), einfach amplifizierte Genome (SAGs) und 1059 metagenomische Proben aus verschiedenen aquatischen Lebensräumen. Wir untersuchten die Pangenomik und die globale Ökologie der Gruppe sowie die Reinkulturphysiologie von zwei unserer Isolate. Unsere Ergebnisse liefern starke Beweise für drei Gattungen innerhalb von IIIa (IIIa.1, IIIa.2 und IIIa.3), deren ökologische Verbreitung zumindest teilweise durch den Salzgehalt definiert wird. Wir definieren die genomischen Anpassungen, die IIIa vom Rest der definierten Kladen von SAR11 und die drei Untergruppen innerhalb von IIIa voneinander trennen, und charakterisieren teilweise die Physiologie und Morphologie von zwei Isolaten aus den IIIa-Zweigen mit kultivierten Vertretern. Unsere in einem definierten und komplexen künstlichen Meerwassermedium gezüchteten SAR11 IIIa-Stämme sowie ihre Genome bieten neue Möglichkeiten für eine detaillierte Untersuchung dieser Gruppe.

Alle Stämme wurden unter Verwendung von Hochdurchsatz-Verdünnungs-bis-Extinktion-Methoden isoliert und durch 16S-rRNA-Gensequenzen identifiziert, wie bereits berichtet [25, 31]. Die DNA für den Stamm LSUCC0261 wurde mit HiSeq (Illumina) nach Bibliotheksvorbereitung sequenziert, wie zuvor in der Oklahoma Medical Research Facility berichtet [19]. Die DNA der Stämme LSUCC0664 und LSUCC0723 wurde zur Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung an die Einrichtung zur Vorbereitung und Sequenzierung von Umweltproben des Argonne National Laboratory geschickt. Wir haben die Reads mit Trimmomatic v0.36 getrimmt und die getrimmten Reads für alle Genome mit SPAdes v3.10.1 [32] unter Verwendung von Standardparametern zusammengestellt, wobei der Coverage-Cutoff auf „auto“ eingestellt war. Wir haben die Schließung der Genome mit Pilon v1.22 [33] überprüft und die Baugruppen mit CheckM v1.0.5 [34] mit „lineage_wf“ auf Kontamination überprüft. Ausführliche Methoden zur Isolierung, Sequenzierung, Assemblierung, Binning und Überprüfung des Genomabschlusses finden Sie im Ergänzungstext.

Um die Anzahl der IIIa-Genome in unserer Analyse zu erhöhen, haben wir MAGs aus der San Francisco Bay (SFB) zusammengestellt (35) und öffentliche Datensätze nach hochvollständigen SAR11-Genomen aus allen Unterklassen mithilfe von GTDB-Tk (36) durchsucht, wie in der Ergänzung angegeben Methoden. Unterklassen innerhalb von SAR11 wurden anhand der phylogenetischen Verzweigung (Ergänzungstext) [37, 38, 39], der BLAST-Identität des 16S-rRNA-Gens, der durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI) [40] und der durchschnittlichen Aminosäureidentität (AAI) (https://github) abgegrenzt .com/dparks1134/CompareM, Standardeinstellungen). Die vergleichende Genomik wurde mit Anvi'o Version 7.1 [41, 42] mit dem Pangenomics-Workflow (https://merenlab.org/2016/11/08/pangenomics-v2) durchgeführt, wie zuvor berichtet [43] unter Verwendung der folgenden Anmerkungsquellen von Interproscan [44] und anvi-estimate-metabolism: SMART, PRINTS, MobiDBLite, KEGG_Class, KOfam, Gene3D, ProSiteProfiles, SUPERFAMILY, Pfam, CDD, Coils, Hamap, ProSitePatterns, PANTHER, SFLD, KEGG_Module, PIRSF und TIGRFAM. Pfam und KOfam wurden hauptsächlich für detaillierte Gensuchen verwendet. Wir haben in den zusammengesetzten Genomen von LSUCC0261, LSUCC0664 und LSUCC0723 mithilfe der Virsorter-Datenbanken „Virome“ und „RefSeq“ nach Bakteriophagen gesucht [45]. Zuletzt verwendeten wir die Ausgabewerte von CheckM v1.0.5 [34] für den Vergleich der Genomeigenschaften (Kodierungsdichte, GC %, vorhergesagte Gene und geschätzte Genomgröße). Wir haben die Genomgröße nicht geschlossener Genome aus öffentlichen Datenbanken geschätzt, die zu mindestens 80 % vollständig waren, indem wir die Anzahl der Basenpaare in der Genomanordnung mit dem Kehrwert des geschätzten Fertigstellungsgrads multipliziert haben (Ergänzungstabelle S1).

Um die Verteilung von Genomen in aquatischen Systemen zu untersuchen, haben wir 1.059 Metagenome für die Leserekrutierung aus den folgenden Regionen und Salzgehaltskategorien ausgewählt: Ostsee (oligo-mesohalin) (46, 47), Chesapeake Bay (USA) (frisch-euhalin) (48). , 49], Columbia River (USA) (oligo-euhalin) [50], Schwarzes Meer (polyhalin) [51], Golf von Mexiko (poly-euhalin) [52], Pearl River (China) (frisch-polyhalin) [ 53], San Francisco Bay (USA) (frisch-euhalin) [35], BioGeoTraces (euhalin) [54], Tara Oceans (poly-euhalin) [55] und der Nordpazifische subtropische Gyre (euhalin) [56] ( Zugangsnummern sind in der Ergänzungstabelle S1 verfügbar). Wir führten eine Lesekartierung und Berechnung normalisierter Häufigkeiten über Lesevorgänge pro Kilobase (des Genoms) pro Million (rekrutierter Lesebasenpaare) (RPKM) unter Verwendung von RRAP durch (57).

Um den Salzgehalt und die Temperaturbereiche unserer Isolate zu testen, haben wir Reinkulturen in ihrem Isolationsmedium bei verschiedenen Ionenstärken und Temperaturen im Dunkeln ohne Schütteln gezüchtet. Um verschiedene C-, N- und S-Substrate zu testen, die von LSUCC0261 verwendet werden könnten, züchteten wir die Kultur in einem modifizierten JW2-Medium, das eine einzelne Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelquelle (Ergänzungstabelle S1) in 96 × 2,1 ml-Well-PTFE enthielt Platten (Radleys, Essex, UK). Die Konzentrationen der Nährstoffquellen wurden wie folgt hinzugefügt, um denen der ursprünglichen Minimalmedien nachzuahmen: Kohlenstoff 500 nM, Stickstoff 5 µM, Schwefel 90 nM für Cystein und Methionin und 500 nM für Taurin. Nach drei aufeinanderfolgenden Transfers der Platten alle 3–4 Wochen übertrugen wir alle Vertiefungen, die eine Zellsignatur auf dem Durchflusszytometer zeigten, in dreifacher Ausfertigung in Kolben mit den entsprechenden C/N/S-Mischungen und einer höheren Konzentration des Kohlenstoffsubstrats (50 µM). ). Alle Kulturen wurden nach Abschluss des Experiments durch Sanger-Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens wie beschrieben erneut auf Reinheit überprüft [31]. Die Zellkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Guava EasyCyte 5HT-Durchflusszytometers (Millipore, Massachusetts, USA) mit zuvor gemeldeten Einstellungen gezählt (19, 31). Die Wachstumsraten wurden mithilfe der Sparse-Wachstumskurve berechnet [58].

LSUCC0261 wurde auf 106 Zellen ml-1 gezüchtet und 50 ml Kultur wurden über Nacht bei 4 °C mit 3 % Glutaraldehyd fixiert. Die Zellen wurden auf einem 0,2-µm-Isopore-Polycarbonat-Membranfilter (MilliporeSigma) filtriert und durch 20-minütiges Waschen mit 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 80 %, 90 %, 95 % und 100 % Ethanol dehydriert. Wir verwendeten ein Tousimis 815 Kritischpunkt-Trocknungssystem mit 100 % Ethanol. Die Filter wurden dann für 45 s in einen Cressington 108-Sputtercoater gelegt und auf dem Rasterelektronenmikroskop JSM-7001F-LV am Core Center of Excellence in NanoImaging der University of Southern California (https://cni.usc.edu) abgebildet. LSUCC0664 wurde auf 106 Zellen ml-1 gezüchtet und 5 µL der Kultur wurden auf ein glimmentladenes 300-Mesh-Kohlenstofffilmgitter (EMS:CF300-cu) geladen. Nach 2 Minuten entfernten wir überschüssige Flüssigkeit mit Filterpapier und färbten 1 Minute lang mit 2 % Uranylacetat (TED Pella Cat: 19481). Die Proben wurden mit einem JEM-1400-Transmissionselektronenmikroskop an der Louisiana State University Shared Instrumentation Facility (https://www.lsu.edu/sif/) abgebildet. Wir haben das Zellvolumen mithilfe des Schwerpunktsatzes von Pappus geschätzt (Ergänzungstext).

Im Verlauf früherer groß angelegter Kultivierungsexperimente haben wir mehrere Stämme von SAR11 IIIa aus dem nördlichen Golf von Mexiko isoliert (23, 31). Wir haben drei dieser Isolate (LSUCC0261, LSUCC0664 und LSUCC0723) für weitere genomische Untersuchungen ausgewählt, basierend auf ihrer Verteilung über den 16S-rRNA-Genbaum innerhalb von SAR11 IIIa (23). Die Genomsequenzierung und -assemblierung führte zu einem einzigen kreisförmigen Contig für jedes isolierte Genom. Wir haben acht SAR11-Genome aus der San Francisco Bay zusammengestellt, von denen zwei Mitglieder der Subklasse IIIa.3 waren (Abb. 1A). Die beiden IIIa.3 MAGs, die aus SFB generiert wurden, waren SFB9D2025, das 0,6 MB groß ist, 52,4 % Vollständigkeit und 5,7 % Kontamination aufweist und aus Gewässern mit einem Salzgehalt von 23,6 erzeugt wurde, und SFB3D203, das 0,9 MB groß ist, 72,6 % Vollständigkeit und 6 % Kontamination aufweist. Kontamination und wurde aus Wasser mit einem Salzgehalt von 5,7 erzeugt. Charakteristisch für andere SAR11-Genome war, dass unsere Isolatgenome und andere aus IIIa einen niedrigen GC-Gehalt (29–30 %) und eine hohe Kodierungsdichte (96 %) aufwiesen (Tabelle 1, ergänzende Abbildung S1). Die Unterklasse IIIa verbindet jedoch die Unterklassen II und LD12 mit kleineren Genomen als die in Unterklasse I (ergänzende Abbildung S1).

Ein paarweiser Phylogenie- und ANI/AAI-Vergleich von SAR11 IIIa und IIIb/LD12. Die Phylogenie ist eine Teilmenge des phylogenomischen Baums in der ergänzenden Abbildung 2. Knotenwerte sind Indikatoren für die Bootstrap-Unterstützung (n = 1000). Sterne weisen auf neue Isolate aus dieser Analyse hin. B 16S rRNA-Gen BLAST-Identität vs. AAI. Graue Balken geben die Arten- und Gattungsdefinitionen unter Verwendung der AAI- (97) und 16S-rRNA-Gene (60) an, sofern angegeben.

Die Phylogenomik von 471 SAR11-Genomen löste unsere Isolate als neue Mitglieder der Subklasse IIIa auf (ergänzende Abbildung S2) und reproduzierte die drei zuvor beobachteten IIIa-Untergruppen, die als IIIa.1, IIIa.2 und IIIa.3 abgegrenzt sind (Abb. 1A). Während kürzlich eine ähnliche Nomenklatur vorgeschlagen wurde [30], haben wir die Untergruppen anhand von Ergebnissen aus mehr Genomen, Aminosäureidentität (AAI) und 16S-rRNA-Genidentität neu klassifiziert (Abb. 1B). Sowohl die 16S-rRNA-Gen- als auch die AAI-Identität zeigen, dass IIIa.1 IIIa.2 ähnlicher ist als IIIa.3 (Abb. 1B). Die niedrigste 16S-rRNA-Genidentität innerhalb IIIa beträgt 92,1 % (Ergänzungstabelle S1). Genome innerhalb einer Untergruppe haben Werte von mindestens 73 % AAI zueinander mit einem Abfall von mindestens 10 % AAI zwischen Untergruppen, was auch darauf hinweist, dass jede Untergruppe eine Klassifizierung auf Gattungsebene mithilfe von AAI darstellt [59] (Abb. 1A, B, Ergänzungstabelle). S1). Nicht alle Genome innerhalb von IIIa enthielten eine 16S-rRNA-Gensequenz, aber diejenigen, die dies taten, teilten innerhalb einer Untergruppe eine 16S-rRNA-Sequenzidentität von >97 %. Dies liegt nahe an der Sequenzidentitätsmetrik von ~98 % für Arten [60]. Wir schlagen daher vor, dass IIIa eine taxonomische Familie darstellt, die aus drei Gattungen besteht.

Wir haben Lesevorgänge aus 1059 aquatischen Metagenomen mit einem Salzgehalt von 0,07–40,2 bis 469 SAR11-Genomen rekrutiert, um die relative globale Verteilung jedes Genoms in Meeres- und Flussmündungssystemen zu bewerten (Ergänzungstabelle S1). Wir haben den Salzgehalt nach dem Venedig-System kategorisiert (<0,5 frisch, 0,5–4,9 oligohalin, 5–17,9 mesohalin, 18–29,9 polyhalin, 30–39,9 euhalin, > 40 hyperhalin) [61] und die RPKM-Werte nach Unterklasse innerhalb einer Salzgehaltskategorie summiert für jede metagenomische Probe. Unterklasse IIIa wies insgesamt eine weite ökologische Verbreitung mit einer Habitatspezialisierung nach Untergruppen auf (Abb. 2A, B). IIIa.1 war in erster Linie eine polyhaline Klade mit begrenzter Rekrutierung an Standorten mit Salzgehalten <18. IIIa.2 war an Euhalin angepasst und weist die geringste relative Häufigkeit von IIIa auf. Die Häufigkeiten von IIIa.1 und IIIa.2 waren im Allgemeinen viel geringer als die von IIIa.3 (Abb. 2B). IIIa.3 war die am häufigsten vorkommende IIIa-Untergruppe mit Salzgehalten <30 und schien hauptsächlich für meso/oligohaline Umgebungen geeignet zu sein (Abb. 2B). Die Genome CP31, CP15, LSUCC0261 und QL1 dominierten die Leserekrutierung in mesohalinen Gewässern, und LSUCC0261 war das am häufigsten vorkommende Isolatgenom (Abb. 2A), im Gegensatz zur vorherigen Verwendung von IMCC9063 und HIMB114 als Vertreter der Subklasse in metagenomischen Rekrutierungsdatensätzen (22). ].

Eine metagenomische Rekrutierung von IIIa- und IIIb/LD12-Genomen an Standorten mit Salzgehalten ≤32. Kacheln stellen eine metagenomische Probe dar, die nach zunehmendem Salzgehalt auf der x-Achse angeordnet sind. Die Farben auf jeder Kachel stellen die Werte der Reads pro Kilobase (des Genoms) pro Million (der rekrutierten Lesebasenpaare) (RPKM) am Standort dar. Die Farben auf der x-Achse geben die Salzgehaltskategorie an, zu der die Probe gehört, klassifiziert nach dem Venice-System [61]. B Boxplot der RPKM-Werte, summiert nach Subklasse für jede metagenomische Probe, gruppiert nach Subklasse und gefärbt nach Salzgehaltskategorie. Die Einfügung zeigt logarithmisch transformierte summierte RPKM-Werte für Unterklasse IIIa an.

Wir haben eine pangenomische Analyse aller 471 SAR11-Genome durchgeführt, um Ähnlichkeiten und Unterschiede im Genomgehalt innerhalb von IIIa sowie zwischen IIIa und anderen SAR11 zu definieren, mit dem Ziel, 1) Unterschiede im Stoffwechselpotenzial zu quantifizieren und 2) genomische Variationen mit unterschiedlichen ökologischen Verteilungen zu verknüpfen. Unsere geschlossenen Isolatgenome und die erweiterte Taxonauswahl innerhalb IIIa ermöglichten es uns zu definieren, ob der zuvor gemeldete genomische Inhalt von IMCC9063 und HIMB114 einzigartige oder definierende Merkmale ihrer jeweiligen Unterklassen darstellte. Obwohl SAR11 möglicherweise zehn Unterklassen [3] oder mehr [30] enthält, haben wir diese für unsere Analyse in die breiten Unterklassen I, II und LD12 zusammengefasst und die Unterklassen IV und V ausgeschlossen, da ihre phylogenetische Einbeziehung in SAR11 die Quelle widersprüchlicher Berichte ist [30, 62,63,64,65,66]. Abbildung 3 fasst die unten hervorgehobenen genomischen Unterschiede zwischen SAR11 zusammen und der vollständige Satz orthologer Cluster ist in der Ergänzungstabelle S1 enthalten.

Farben und Text in den Kästchen geben den Anteil der Genome in einer Subklasse an, in der das Gen/der Signalweg vorhanden ist. Gensuiten für ABC-Transporter oder mehrere Schritte in einem Prozess werden nur dann notiert, wenn alle Komponenten vorhanden sind, während dies bei bemerkenswerten Signalwegen, denen eine Komponente fehlt, der Fall ist im Text vermerkt.

Zentraler Kohlenstoff. IIIa hatte Gene für den Pentosephosphatweg, den TCA-Zyklus und die Glucose-6-Phosphat-Isomerase wie die Unterklassen I, II und LD12 vorhergesagt. IIIa fehlte das EMP-Glykolyse-Markergen Phosphofructokinase, das die Unterklassen II und LD12 besaßen. Abgesehen von einem Mitglied von IIIa.1 fehlte IIIa auch die Pyruvatkinase, die häufig in LD12 und MAGs und SAGs in den Unterklassen I und II vorkommt. IIIa enthielt Pyruvatdehydrogenase (aceEF) wie die Unterklassen I, II und LD12. Sechs Genome innerhalb von IIIa enthielten mindestens zwei Kopien von aceE, wobei QL1 fünf Kopien enthielt. Isocitratlyase ist das erste Enzym im Glyoxylat-Shunt, das Isocitrat in Glyoxylat und Succinat spaltet. Der Glyoxylat-Shunt war in IIIa nicht konserviert (Abb. 3), da nur 2/8 der Genome in IIIa.1 und 5/9 der Genome in IIIa.3 Isocitratlyase enthielten, einschließlich LSUCC0664 (IIIa.1) und LSUCC0261 (IIIa.3). ). Das geschlossene Isolatgenom von LSUCC0723 (IIIa.1) enthielt jedoch keine vorhergesagte Isocitratlyase, was es zum ersten gemeldeten Isolat macht, dem dieser Signalweg fehlt. Der zweite Schritt des Glyoxylat-Shunts wird durch Malat-Synthase ausgeführt, die in IIIa und allen anderen Unterklassen von SAR11 üblich war. Untergruppe IIIa.3 und ein einzelnes Nicht-IIIa-Genom, SCGCAAA240_E13, enthielten AcyP, das ein Acylphosphat in ein Phosphat, eine Carboxylgruppe und ein Proton spaltet.

C1-Stoffwechsel. Den meisten IIIa-Genomen fehlten Formiat-Tetrahydrofolat (THF)-Ligase und Formiatdehydrogenase für die Produktion von Formiat und CO2 aus dem THF-verknüpften Oxidationsweg, mit Ausnahme von CP31 (IIIa.3), das beides aufwies (Abb. 3). Allen IIIa-Genomen fehlten die Methylamin-Oxidationsgene, die in I/II SAR11 üblich waren, wie zuvor für HIMB114 berichtet [8]. Zwei IIIa.3-Genome, CP31 und LSUCC0261, und sechs LD12-Genome (einschließlich des geschlossenen Isolatgenoms LSUCC0530) enthielten eine natriumabhängige Bicarbonat-Transportpermease in der SBT-Proteinfamilie. In Süßwasser- und Flussmündungs-Cyanobakterien fungiert dieses Protein als hochaffiner Bikarbonattransporter, der anorganischen Kohlenstoff in der Zelle konzentriert [67]. Dieser wahrscheinliche Bicarbonattransporter wurde nur in CP31 und LSUCC0261 in IIIa.3 gefunden, die auch zwei der Genome waren, die stark Mündungsmetagenome rekrutierten (Abb. 2). Obwohl nicht bekannt ist, dass SAR11 anorganischen Kohlenstoff für das Wachstum nutzen kann, enthalten ihre Genome Carboanhydrase und anaplerotische Enzyme, um anorganischen Kohlenstoff als Zwischenprodukte in Abschnitten des zentralen Kohlenstoffstoffwechsels zu nutzen [68].

Aminosäuren. IIIa und LD12 verfügten über die D-Alanin-Transaminase- und Alanin-Racemase-Gene, um Alanin in Pyruvat umzuwandeln, während andere SAR11 dies nicht taten. Vierzehn von zwanzig Genomen aus IIIa, einschließlich unserer drei Isolatgenome, enthielten serABC für die Produktion von Serin und Glycin aus der Glykolyse. Isolaten in Subklasse I fehlte offenbar die komplette Gensuite und sie waren daher für ihren zellulären Bedarf auf externes Glycin und Serin angewiesen [10, 13]. Unsere Analyse ergab jedoch, dass diese Gensuite in einigen MAGs und SAGs innerhalb von I/II und LD12 vorhanden war ( Abb. 3). IIIa und LD12 wiesen außerdem mehrere Kopien von metE auf, einer B12-unabhängigen Methionin-Synthase. Obwohl dieses Gen in I/II-Genomen vorhanden war, hatten Mitglieder von IIIa.3 und LD12 bis zu drei Kopien, die sich über mehrere orthologe Gencluster erstreckten (Ergänzungstabelle S2).

Schwefel. Wie alle SAR11 scheint IIIa von reduzierten Schwefelverbindungen abhängig zu sein und enthielt keine vollständigen assimilatorischen oder dissimilatorischen Sulfatreduktionswege [17, 19]. Es wurde vorhergesagt, dass I/II SAR11 DMSO und DMSP verwendet, aber allen IIIa-Genomen sowie LD12 fehlte dmdA für die Verwendung von DMSP über den Demethylierungsweg, was die vorherige Beobachtung in den Isolatgenomen IMCC9063 und HIMB114 bestätigt [69].

Stickstoff und Urease. Es wurde vorausgesagt, dass alle SAR11 Ammoniak verwenden und Glutamat und Glutamin synthetisieren, obwohl die Wege, auf denen Glutamat synthetisiert wurde, unterschiedlich waren. Fast die Hälfte von IIIa und die meisten LD12-Mitglieder hatten glnB, einen Teil des P-II-Stickstoffreaktionssystems, der häufig in Proteobakterien vorkommt und in anderen Mitgliedern von SAR11 fehlt [12] (Abb. 3). Das P-II-assoziierte glnD-Gen wurde in keinem Genom gefunden, daher ist unklar, welche Unterschiede in der Stickstoffantwort glnB gegebenenfalls für IIIa/LD12 hervorrufen kann. Wir fanden ein Urease-Gensuite-Operon, ureABC und akzessorische Proteine ​​ureEFGHJ im Genom des Isolats LSUCC0261 (IIIa.3) mit dem Nickel/Peptid-ABC-Transporter, der häufig in SAR11 vorkommt. Funktionelle Urease-Operons erfordern einen Nickel-Cofaktor [70], daher deutete das Vorhandensein der Urease und der akzessorischen Proteine ​​direkt stromabwärts des ABC-Transporters auf eine wahrscheinliche funktionelle Gensuite hin, die wir durch Wachstumsexperimente (unten) bestätigten. Sechsunddreißig MAGs aus Subklasse I enthielten auch die Urease-Gensuite (Ergänzungstabelle S2). Urease in SAR11 wurde erstmals in der Sauerstoffmangelzone im östlichen tropischen Nordpazifik berichtet, wo Berichten zufolge bis zu 10 % von SAR11 die Gene enthielten [71]. Unser Isolat ist das erste gemeldete SAR11-Isolat, das Urease enthält, und das einzige noch vorhandene Mitglied von IIIa oder LD12 mit diesen Genen.

Polyhydroxyalkanoate. Wir fanden, dass 11/20 Genome in IIIa.1/IIIa.3 und 8/11 Genome in LD12 phaABC und ein zugehöriges Phasin-Protein für die vorhergesagte Produktion und Verwendung von Polyhydroxybutyrat (oder einem anderen Polyhydroxyalkanoat) enthielten (Abb. 3). In anderen Organismen ermöglichen PhaABC- und Phasin-Proteine ​​den Zellen die intrazelluläre Speicherung von Kohlenstoff, wenn der Kohlenstoffgehalt hoch ist, aber ein anderer wesentlicher Wachstumsbestandteil wie Stickstoff, Phosphor, Magnesium oder Sauerstoff einschränkend/unausgeglichen ist [72]. Es wurde auch festgestellt, dass diese Körnchen Zellen vor Stressfaktoren wie Temperatur, reaktiven Sauerstoffspezies, osmotischem Schock, oxidativem Stress oder UV-Schäden schützen [73]. Über diese Gene wurde bereits in begrenzten IIIa.1-Genomen berichtet (74, 75), aber wir erweitern diese Beobachtung auf weitere Isolate und bestätigen, dass das Potenzial der Speichergranulatsynthese ein weit verbreitetes Phänomen in den Unterklassen IIIa und LD12 ist. Darüber hinaus steht dieser potenzielle Phänotyp im Gegensatz zum Konzept, dass ozeanische SAR11-Zellen Phosphat in einem extrazellulären Puffer speichern [76]. Der Selektionsdruck für diese Genreihe erfordert angesichts des breiten Funktionsspektrums dieser Verbindungen und der allgemein hohen Nährstoffbelastung von Küsten- und Brackwasser, in denen IIIa und LD12 vorherrschen, weitere Untersuchungen.

Metalle. Der in Subklasse I/II SAR11 übliche Fe3+-ABC-Transporter wurde in IIIa gefunden. Zwei IIIa.1-, drei IIIa.3- und sieben LD12-Vertreter sowie drei Subclade-I/II-Genome enthielten auch efeU, einen hochaffinen Eisen-Eisen-Transporter (Fe2+), und IIIa.3- und LD12-Mitglieder enthielten einen Eisen-Eisen-Transporter ( Fe2+) EffluxpumpenfieF zur Entfernung von Eisen und Zink aus Zellen [77] (Abb. 3). Es wurde festgestellt, dass Mündungssysteme erhebliche Mengen an verfügbarem Fe2+ enthalten [78], sodass diese Gene auf eine potenzielle Eisenverfügbarkeitsnische hinweisen, von der einige dieser spezialisierten SAR11 profitieren können.

Kompatible gelöste Stoffe. Eine Ectoinpermease wurde in allen SAR11-Unterklassen mit Ausnahme von IIIa.2 und LD12 gefunden, es wurde jedoch vorhergesagt, dass nur die IIIa.3-Mitglieder LSUCC0261, CP15 und CP55 (und vier SAGS aus anderen Unterklassen) Hydroxyectoin aus Ectoin synthetisieren (Abb. 3). Hydroxyectoin ist ein osmoprotektives Breitbandmolekül für Zellen, kann Zellen vor Austrocknung schützen und seine Produktion wurde während der stationären Phase erhöht, wenn es unter hohem Salzstress in einem Minimalmedium in halophilem Virgibacillus halodenitrificans PDB-F2 gezüchtet wurde [79, 80]. Der Glycin-Betain/Prolin-Transporter war in IIIa vorhanden, aber die IIIa.3-Vertreter LSUCC0261, CP15 und QL1 waren die einzigen Mitglieder, die alle Untereinheiten, einschließlich der ATP-bindenden Untereinheit, enthielten. Dieser Transporter fehlte in LD12 vollständig [19]. Die IIIa.3-Mitglieder LSUCC0261 und CP15 waren die einzigen Mitglieder von IIIa, die wie die Unterklassen I/II Taurin transportieren konnten. In IIIa fehlten außerdem Mannitol-Synthese/-Transport, Sorbitol-Transport, Sarkosin-Synthese und TMAO-Synthese, obwohl diese Systeme in einigen anderen I/II-SAR11 zu finden sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass IIIa eine mittlere Anzahl kompatibler gelöster Gene enthielt, die zwischen denen von I/II und LD12 lag (Abb. 3). IIIa.3 enthielt die am besten kompatiblen gelösten Gene innerhalb von IIIa.

Vitamine/Cofaktoren und andere genomische Merkmale. Sechs IIIa.3-Genome (einschließlich der Isolate IMCC9063 und LSUCC0261), ein IIIa.1-Genom und drei SAGs außerhalb von IIIa enthielten zehnA, das es den Zellen im Gegensatz zu anderen SAR11 ermöglichen sollte, AmMP anstelle von HMP als Quelle für Thiamin-Vorläufer zu verwenden [14]. ], Diese Unterscheidung ist interessant, weil wir auch bestätigt haben, dass der zuvor berichtete Verlust des thiL-Gens [14] zur Phosphorylierung von Thiaminmonophosphat zu biologisch verfügbarem Thiamindiphosphat (TPP) in der gesamten Subklasse IIIa erhalten blieb. Obwohl IIIa möglicherweise eine gewisse Nischendifferenzierung von Ia durch den Import eines anderen Thiamin-Vorläufers aufweist, ist ungeklärt, wie IIIa TPP für die Verwendung in der Zelle produziert (Ergänzungstext). Wie andere SAR11 hatte IIIa Proteorhodopsin – IIIa.1 war eine Mischung aus Grün und Blau (Aminosäure L/Q an Position 105), IIIa.2 hatte Blau, IIIa.3 hatte Grün (Abb. S3, Ergänzungstext) . Diese spektralen Abstimmungen entsprechen der ökologischen Verteilung und Quelle der Genome, wobei Genome aus Mündungssystemen mit mesohalinen/polyhalinen Verteilungen in grüner Farbe stammen. HIMB114, CP1 und AG_894_A09 enthielten zwei Kopien von Proteorhodopsin, die zu zwei orthologen Clustern gehörten (Ergänzungstabelle S2), deren Auswirkungen derzeit unklar sind und weiterer Untersuchungen bedürfen. Die Isolate LSUCC0723, LSUCC0664 und LSUCC0261 enthielten laut Virsorter (Ergänzungstabelle S1) keine identifizierbaren Bakteriophagensignaturen.

Wir haben die Salzgehaltstoleranzen von zwei Isolaten innerhalb IIIa, LSUCC0664 (IIIa.1) und LSUCC0261 (IIIa.3), getestet, um die oben gemeldeten ökologischen Daten zu kontextualisieren und zu verstehen, ob die Verteilung in ökologischen Daten die physiologischen Fähigkeiten der Organismen widerspiegelt. LSUCC0664 (IIIa.1) wuchs bei Salzgehalten von 5,8–34,8 und LSUCC0261 (IIIa.3) wuchs bei Salzgehalten von 1,5–34,8, beide mit einem Optimum von 11,6. Obwohl die beiden Isolate einen überlappenden Salzgehaltswachstumsbereich aufweisen, wuchs LSUCC0261 (IIIa.3) bei allen Salzgehalten außer 23,3 und 34,8 schneller als LSUCC0664 (IIIa.1) und konnte insbesondere bei niedrigeren Salzgehalten als LSUCC0664 wachsen (Abb. 4). Diese Daten deuten darauf hin, dass die IIIa-Untergruppen Euryhalin sind (in der Lage, ein breites Spektrum an Salzgehalten zu bewohnen), im deutlichen Gegensatz zur Schwestergruppe LD12 [19]. Wir haben auch das Isolat LSUCC0261 (IIIa.3) auf seinen Temperaturbereich/Optimum getestet. Es könnte bei Temperaturen von 12–35 °C wachsen, wobei sein Optimum von 30 °C auf eine Bevorzugung wärmerer Gewässer hinweist (ergänzende Abbildung S4). Während die Wachstumsraten zwischen 30 und 35 ° C ähnlich waren, wuchs LSUCC0261 bei 30 ° C zu einer höheren Zelldichte (ergänzende Abbildung S4).

Wachstumsraten und Verdoppelungszeiten von LSUCC0664 (IIIa.1) in Orange und LSUCC0261 (IIIa.3) in Blau in Medien mit unterschiedlichem Salzgehalt.

Wir haben LSUCC0261 (IIIa.3) in minimalen künstlichen Meerwassermedien gezüchtet, um die Fähigkeit des Isolats zu testen, einzelne Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelquellen mit einer Vielzahl von Substratkombinationen zu nutzen (Ergänzungsabbildungen S5 und S6, Ergänzungstabelle S1). Wir haben Pyruvat, Citrat, Ribose, Acetat, Succinat und α-Ketoglutarsäure als C-Quellen, Harnstoff und Ammoniak als N-Quellen sowie Cystein und Methionin als S-Quellen getestet. Oxalessigsäure, Taurin, Dextrose, Sulfat, DMSO und DMSP unterstützten das Wachstum nicht. Diese Ergebnisse stimmen mit den Vorhersagen der Genomik überein, mit Ausnahme von Oxalessigsäure, die aufgrund des Vorhandenseins von maeB und seiner Verwendung im Isolat HTCC1062 als Kohlenstoffquelle hätte verwendet werden können [10]. Auch im Gegensatz zu unserer Studie war HTCC1062 in der Lage, Taurin, aber nicht Acetat als Ersatz für Pyruvat zu verwenden [10], was auf mehrere physiologische Unterschiede zwischen den beiden Isolaten hinweist.

Rasterelektronenmikroskopie für LSUCC0261 und Transmissionselektronenmikroskopie für LSUCC0664 zeigten, dass es sich bei beiden Zellen um gebogene Stäbchen wie bei anderen SAR11-Zellen handelte, die in den Poren eines lasergeätzten 0,1-μm-Filters haften konnten (Abb. 5A, B). Wir schätzten die Zellen auf 100–300 nm Dicke für LSUCC0261 und 150–240 nm Dicke für LSUCC0664 (Ergänzende Abbildung S7K), 0,2–1 μm Länge für LSUCC0261 und 0,4–1,5 μm Länge für LSUCC0664 (Ergänzende Abbildung S7L), mit Volumina zwischen 0,01–0,05 μm3 für LSUCC0261 und 0,015–0,04 μm3 für LSUCC0664 (Ergänzende Abbildung S7M). Diese Werte stimmen mit anderen Schätzungen von SAR11 überein (81) und bestätigen somit die konservierte Morphologie über große Evolutionsdistanzen bei den Pelagibacterales. Diese Größen sind auch bemerkenswert, da die SAR11-Durchmesser es einigen Zellen ermöglichen könnten, traditionell verwendete 0,2-µm-Filter zu passieren, während ihre Längen dazu führen könnten, dass sie auf Filtern von 0,8–1 µm gesammelt werden, die manchmal zur Trennung „partikelgebundener“ Taxa verwendet werden. Daher kann es sein, dass SAR11 in Metagenomen mit Fraktionsgrößen von 0,2–1 µm tatsächlich zu wenig abgetastet ist.

Ein Rasterelektronenmikroskopbild einer einzelnen LSUCC0261-Zelle. B Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme vieler LSUCC0261-Zellen und Zelltrümmer. AB zeigt einen Maßstabsbalken von 1 µm an. C Transmissionselektronenmikroskopisches Bild einer einzelnen LSUCC0664-Zelle, wahrscheinlich in der Mitte der Teilung, mit einem Maßstabsbalken von 200 nm.

Diese Studie ist die erste, die sich systematisch auf die SAR11-Subklasse IIIa konzentriert, und stellt die aktuellste pangenomische Studie hochwertiger öffentlich verfügbarer SAR11-Genome und ihrer phylogenetischen Beziehungen dar. Wir haben mehrere neue Reinkulturen, ihre vollständigen Genome und 2 IIIa MAGs beigesteuert. Frühere Berichte über den Genomgehalt von IIIa konzentrierten sich hauptsächlich auf Ausnahmen vom Metabolismus anderer SAR11-Unterklassen. Mit unserer erweiterten Genomauswahl haben wir festgestellt, ob es sich bei diesen Befunden um konservierte Merkmale in IIIa oder nur um einzelne Isolate handelte. Unsere Studie stellt Glycin- und Serin-Prototrophie, Verlust von DMSO, DMSP und einem Großteil des C1-Metabolismus, das Vorhandensein von phaABC-Genen, Verlust von thiL und eine Mosaikverteilung des Glyoxylat-Shunts als konservierte genomische Merkmale innerhalb von IIIa fest.

Darüber hinaus haben wir mehrere dieser genomischen Vorhersagen durch Wachstumsphysiologie bestätigt. Die Isolierung der Taxa LSUCC0261, LSUCC0664 und LSUCC0723 testete die Serin- und Glycin-Prototrophie, da LSUCC0261 in JW2-Medium isoliert wurde, das kein Glycin oder Serin enthielt, und LSUCC0664 und LSUCC0723 in einem anderen Medium, MWH2, isoliert wurden, das weder Glycin noch Serin enthielt beides, enthielt aber Glycinbetain. HTCC1062 könnte Glycinbetain als Ersatz-Glycinquelle oxidieren [10], aber LSUCC0664 und LSUCC0723 verfügen nicht über die Gene, um Glycinbetain in Glycin umzuwandeln. Somit bestätigt die Kultivierung und Vermehrung dieser Isolate in unseren Medien die Glycin- und Serin-Prototrophie in IIIa. Darüber hinaus benötigte LSUCC0261 in Experimenten mit minimalem Medium kein Glycin oder Serin (ergänzende Abbildung S4) und konnte die reduzierten Schwefelverbindungen DMSP und DMSO nicht wie andere SAR11 verwenden (28).

Diese Studie ist das erste berichtete Wachstum eines SAR11-Isolats unter Verwendung von Harnstoff als einziger Stickstoffquelle. Die Aufnahme von markiertem Harnstoff durch SAR11 wurde in situ beobachtet und die Urease kann in OMZ SAR11 häufig vorkommen [71]. Während wir die Urease-Gensuite nur in einem IIIa-Genom (LSUCC0261) beobachteten, wurden diese SAR11-Urease-Gene in allen Metagenomen der Wassersäule der San Francisco Bay gefunden (ergänzende Abbildungen S8 und S9), was darauf hindeutet, dass dieser Metabolismus für SAR11 in der Flussmündung wichtig ist. Zukünftige Arbeiten werden erforderlich sein, um festzustellen, ob LSUCC0261 Harnstoff als Stickstoff-, Kohlenstoff- oder beidesquelle verwendet, die Häufigkeit von Urease in Küstenpopulationen zu untersuchen und die Umstände zu identifizieren, unter denen Urease einen Wettbewerbsvorteil bei SAR11 bietet.

Weit davon entfernt, eine monolithische Unterklasse mit universellen Merkmalen zu sein, schlagen wir vor, dass die Unterklasse IIIa eine Familie innerhalb der Ordnung Pelagibacterales darstellt und dass die Untergruppen den Gattungen entsprechen, die sowohl durch die 16S-rRNA-Genidentität als auch durch AAI definiert sind (Abb. 1) (59, 60). Die Gattungen hatten einzigartige räumlich-zeitliche Verteilungen (Abb. 2B), was mit unserem Verständnis der historischen Abgrenzung verschiedener SAR11-Ökotypen übereinstimmt [3, 6, 30, 82]. Frühere Studien definierten drei phylogenetische Zweige, die durch HIMB114 repräsentiert werden, als einen Küstenzweig (IIIa.1), IMCC9063 (IIIa.3) als einen mesohalinen Zweig und einen unkultivierten ozeanischen Zweig dazwischen [3, 22]. Unsere erweiterte Taxonauswahl und der Vergleich mit mehr als tausend Metagenomen verfeinern unser Verständnis der Subklassenverteilung. Während IIIa.3 die am häufigsten vorkommende Untergruppe insgesamt war, bevorzugten diese Organismen einen etwas niedrigeren Salzgehalt als IIIa.1, und IIIa.2 war hauptsächlich eine Meeresgruppe. Eine solche Differenzierung des Salzgehalts im feinen Maßstab wurde durch physiologische Daten gestützt. Das IIIa.1-Isolat LSUCC0664 konnte bei den niedrigsten möglichen Salzgehalten für LSUCC0261 (IIIa.3) nicht wachsen (Abb. 4). LSUCC0261 war auch am besten an mittlere Salzgehalte angepasst, während LSUCC0664 im Vergleich dazu bei höheren Salzgehalten viel besser wuchs (Abb. 4).

Zwischen den Untergruppen innerhalb von IIIa besteht eine große Stoffwechselvielfalt, wobei IIIa.3 am deutlichsten ausgeprägt ist. Mehrere Stoffwechselmerkmale kamen nur bei IIIa.3 vor oder wurden nur mit der Süßwassergruppe LD12 gemeinsam. Zusätzlich zur Fähigkeit, Fe3+ wie andere SAR11 über den ABC-Transport zu transportieren, kann IIIa einen hochaffinen Eiseneisentransporter (Fe2+) nutzen und IIIa.3/LD12 kann Fe2+ und Zink aus Zellen pumpen [77]. IIIa.3 enthielt AcyP, das Acylphosphat in Phosphat und Carboxylat spaltet, was als parallele evolutionäre Taktik zum Abfangen von Phosphat dienen könnte, ähnlich der Methylphosphonat-Spaltung in Ia-Genomen wie HTCC7211 [83], oder einfach als zusätzliche Möglichkeit zum Recycling dienen könnte Acetat für den zentralen Kohlenstoffstoffwechsel der Zelle. IIIa.3 hat das Potenzial, dass AmMP aufgrund des Vorhandenseins von tenA den Thiaminbedarf erfüllt, anstatt wie die meisten anderen SAR11 [14] auf HMP angewiesen zu sein. In einer kürzlich durchgeführten Untersuchung der Konzentrationen von Thiamin-verwandten Verbindungen im Nordatlantik wurde AmMP an mehreren Meeresstationen in ähnlichen, aber höheren Konzentrationen als HMP gefunden [84]. Dies stellt einen entscheidenden Nischendifferenzierungsschritt für IIIa.3 von anderen SAR11 dar, einschließlich der Schwestergruppen IIIa.1 und IIIa.2, die wahrscheinlich auf HMP angewiesen sind [14]. Die konservierte Deletion von thiL in Subklasse IIIa, das Thiaminmonophosphat (TP) in das biologisch nutzbare Thiamindiphosphat (TPP) umwandelt, bleibt unerklärlich, da es den Anschein hat, dass diese Organismen immer noch Thiamindiphosphat benötigen. Beispielsweise weisen acht Genome, die die drei Untergruppen innerhalb von IIIa abdecken, mehrere Genkopien der aceE-E1-Komponente der Pyruvatdehydrogenase auf, und QL1 weist fünf Kopien auf. Dies ist bemerkenswert, weil die Genduplikationen in SAR11 begrenzt sind [8] und auch weil aceE Thiamindiphosphosphat als Cofaktor benötigt, um Thiamindiphosphat und Pyruvat zu Acetyl-CoA zu kombinieren [85]. Es ist daher wahrscheinlich, dass ein derzeit nicht annotiertes Gen diese endgültige Umwandlung abschließen kann. Ein möglicher Kandidat ist eine Adenylatkinase, die in allen SAR11 vorkommt und Thiamindiphosphat in Thiamintriphosphat umwandeln kann [86]. Zusammengenommen ermöglichen diese bemerkenswerten Stoffwechselverschiebungen in IIIa.3 der Subklasse wahrscheinlich die Nutzung von Umweltressourcen, die andere SAR11 nicht nutzen können, und tragen zum ökologischen Erfolg der Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen in IIIa bei.

Es wird angenommen, dass authentische, an das Flussmündungsgebiet angepasste Taxa im Vergleich zu Meeres- und Süßwasserversionen selten sind [87]. Frühere Untersuchungen an Flussmündungen diskutierten darüber, ob es tatsächlich an Flussmündungen angepasste Abstammungslinien geben könnte oder ob die Gemeinschaftsmitglieder in Flussmündungszonen einfach eine Mischung aus Süßwasser- und Meeresgemeinschaften sind, da die kurzen Verweilzeiten von Flussmündungswasser eine etablierte Gemeinschaft unwahrscheinlich machen [88]. Eine echte Brackwassergemeinschaft in der Ostsee mit einem Salzgehalt von 5–8 unterschied sich jedoch von frischen und salzigen Gemeinschaftsmitgliedern [89]. Die Physiologie, die ökologische Verteilung, der Gengehalt und die Schwesterposition von IIIa zu LD12 stützen alle das Konzept eines mündlichen Ursprungs des letzten gemeinsamen Vorfahren von IIIa/LD12. Anschließend blieb eine Untergruppe von IIIa an das Ästuar angepasst (IIIa.3), während sich die anderen Untergruppen im Laufe der Zeit in Nischen mit immer höherem Salzgehalt diversifizierten (IIIa.1 und IIIa.2). Solche Meer-Süßwasser-Übergänge in der Evolution bakterieller Abstammungslinien sind selten [90], obwohl wir mehr Beispiele finden, je mehr Daten verfügbar sind [91]. Kürzlich wurde dokumentiert, dass Bakterien wie die Methylophilaceae ihren Ursprung im Süßwasser als Verwandte im Meer haben [92], und einige Diatomeen wie die Thalassiosirales weisen ausgedehnte Übergänge vom Meer zum Süßwasser auf, gefolgt von anschließenden Übergängen im Meer [93]. Während IIIa eine Übergangsklade zu sein scheint, die sich von Flussmündungsgewässern zurück zu Meeressystemen diversifiziert, sind weitere Genome und weitere Forschungen zur Physiologie und Biogeographie erforderlich, um unser Verständnis der evolutionären Ursprünge und Flugbahn dieser Gruppe zu verbessern.

Allgemeiner gesagt stellt Subklasse IIIa eine Zwischengruppe im evolutionären Übergang von SAR11 vom Meeres- zum Süßwasser dar. Diese Organismen leben in einem breiten Salzgehaltsbereich, sind jedoch Brackwasserspezialisten und haben einen jüngsten gemeinsamen Vorfahren mit der ausschließlich Süßwasser- und Brackwasser-Subklasse LD12. Es wird angenommen, dass der letzte gemeinsame Vorfahr aller SAR11 ein stromlinienförmiger Meeresorganismus war [94], und wir gehen derzeit davon aus, dass ein wichtiger Evolutionsschritt, der die Besiedlung von Süßwasser ermöglichte, durch den Verlust von Osmolyttransportgenen (für Glycin-Betain, Prolin) erfolgte , Ectoin und Hydroxyectoin) im LD12-Zweig [19]. Der Nachteil für diesen Genverlust war, dass LD12 daran gehindert wurde, wieder in Salzgewässer einzudringen [19]. Wir können das aus dieser Studie gewonnene Wissen über Subklasse IIIa nutzen, um weiter über den Treiber dieses evolutionären Übergangs zu spekulieren. Die beiden Isolate LSUCC0261 und LSUCC0664 weisen einen Euryhalin-Wachstumsbereich auf. Während dies an sich schon bemerkenswert ist, ist es vielleicht noch wichtiger, dass LSUCC0261 in den getesteten Medien mit dem niedrigsten Salzgehalt, also Süßwasser, nicht wachsen konnte. Was dieses Wachstum bei den frischesten Salzgehalten verhindert, bleibt eine wichtige Frage. Hauptmerkmale von SAR11 sind kleine, stromlinienförmige Genome, die vergleichsweise wenig regulatorische Fähigkeiten aufweisen [9] und eine große Anzahl konstitutiv exprimierter Gene [95]. Ein wahrscheinliches Szenario ist, dass die konstitutive Expression von Osmolyttransportergenen IIIa diese Taxa daran hindert, Süßwasser zu besiedeln, so dass ihr Verlust es den LD12-Abstammungslinien ermöglicht, den Übergang von Taxa mit niedrigem Brackwassergehalt zu echten Süßwassertaxa abzuschließen. Wir untersuchen diese Hypothese derzeit mit Isolaten aus IIIa und LD12. Während der Evolutionsverlauf für LD12, wie oben beschrieben, möglicherweise über den gemeinsamen Vorfahren von IIIa und LD12 verläuft, häufen sich Hinweise darauf, dass die angeblich ausschließlich marinen SAR11-Gruppen auch Süßwasserumgebungen besiedeln können, entweder sporadisch, in sehr geringer Häufigkeit oder beides [91, 96]. ].

Insgesamt stellt diese Studie die bislang umfassendste Analyse von SAR11 IIIa dar und ist ein notwendiger Schritt zum Verständnis von SAR11 IIIa, seiner Rolle in Flussmündungssystemen und seiner Zwischenstellung in der Entwicklung von SAR11 von Meeres- zu Süßwasserumgebungen. Zukünftige Arbeiten zu IIIa sind erforderlich, um die Funktionen der festgestellten Genverluste und -gewinne, die Art und Weise, in der IIIa mit Thiaminderivaten interagiert, und das Ausmaß, in dem IIIa-Mitglieder mit der Nährstoffdynamik in Flussmündungen, einschließlich Harnstoff und der Produktion von Polyhydroxyalkanoaten, interagieren, zu kontextualisieren.

Neue aus dieser Studie hinzugefügte Genome sind auf FigShare unter (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.21350343) verfügbar. Zusammengesetzte Isolatgenome für LSUCC0261, LSUCC0664 und LSUCC0723 sind auf IMG unter den Genom-IDs 2728369215, 2770939455 bzw. 2739368061 verfügbar. Rohdaten des Isolatgenoms sind auf NCBI unter der Zugangsnummer PRJNA864866 verfügbar. Metagenom-assemblierte Genome aus der San Francisco Bay sind auf NCBI unter den BioSample-Zugängen SAMN30106608-SAMN30106615 verfügbar. Die zusätzlichen Datenblätter dieser Veröffentlichung, einschließlich der Pangenom-Zusammenfassung, werden über FigShare (https://figshare.com/projects/Ecophysiology_and_genomics_of_the_brackish_water_adapted_SAR11_subclade_IIIa/144939) gehostet. Kryobestände der in dieser Analyse verwendeten Isolate sind auf Anfrage erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir möchten der Louisiana State University Shared Instrumentation Facility (SIF) und dem University of Southern California Center for Electron Microscopy and Microanalysis (CEMMA) für die Schulung und die Verfügbarkeit von Elektronenmikroskopen zur Abbildung unserer Isolate danken. Wir möchten außerdem Dr. Casey Barr für seine Ausbildung am Rasterelektronenmikroskop und Dr. Ying für ihre Bedienung des Transmissionselektronenmikroskops danken. Die Autoren danken dem Center for Advanced Research Computing (CARC) an der University of Southern California (https://carc.usc.edu) sowie den Hochleistungsrechnerressourcen der Louisiana State University (http://www. hpc.lsu.edu) und das Stanford Research Computing Centre für die Bereitstellung von Computerressourcen, die zu den in dieser Veröffentlichung berichteten Forschungsergebnissen beigetragen haben. Diese Arbeit wurde durch einen Simons Early Career Investigator in Marine Microbial Ecology and Evolution Award und Zuschüsse des NSF Biological Oceanography Program (OCE-1747681 und OCE-1945279) an JCT unterstützt.

Open-Access-Finanzierung durch SCELC, Statewide California Electronic Library Consortium.

Department of Biological Sciences, University of Southern California, Los Angeles, CA, 90089, USA

V. Celeste Lanclos, Conner Y. Kojima, Chuankai Cheng und J. Cameron Thrash

Abteilung für Erdsystemwissenschaften, Stanford University, Stanford, CA, 94305, USA

Anna N. Rasmussen und Christopher A. Francis

Department of Geophysical Sciences, University of Chicago, Chicago, IL, 60637, USA

Michael W. Henson

Abteilung für Biowissenschaften und Museum für Naturwissenschaften, Louisiana State University, Baton Rouge, LA, 70803, USA

Brant C. Faircloth

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VCL führte Datenanalysen und Experimente durch, generierte die Zahlen und verfasste die Arbeit. ANR, CYK und CC führten Datenanalysen durch und trugen zu den Zahlen bei. MWH, BCF und CAF steuerten Stämme, Daten und/oder Reagenzien bei. JCT konzipierte die Studie, beschaffte Fördermittel, führte Datenanalysen durch und unterstützte bei der Erstellung des Manuskripts. Alle Autoren haben Änderungen am endgültigen Manuskript vorgenommen.

Korrespondenz mit J. Cameron Thrash.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lanclos, VC, Rasmussen, AN, Kojima, CY et al. Ökophysiologie und Genomik der an Brackwasser angepassten SAR11-Subklasse IIIa. ISME J 17, 620–629 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01376-2

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Eingegangen: 02. August 2022

Überarbeitet: 06. Januar 2023

Angenommen: 20. Januar 2023

Veröffentlicht: 04. Februar 2023

Ausgabedatum: April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01376-2

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