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Oct 31, 2023

Die komplexe Kompetenzregulation bei Staphylococcus aureus unter mikroaeroben Bedingungen

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 512 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Um eine natürliche Transformation durchzuführen, einen der drei Hauptmechanismen des horizontalen Gentransfers, müssen Bakterien in einen physiologischen Differenzierungszustand eintreten, der als genetische Kompetenz bezeichnet wird. Interessanterweise werden oft neue Bakterien entdeckt, die eine solche Fähigkeit aufweisen, und einer der neuesten ist der menschliche Krankheitserreger Staphylococcus aureus.

Hier zeigen wir ein optimiertes Protokoll, das auf Planktonzellkulturen basiert und dazu führt, dass ein großer Prozentsatz der Bevölkerung die Kompetenzentwicklung aktiviert und die natürliche Transformationseffizienz von S. aureus deutlich verbessert. Unter Ausnutzung dieser Bedingungen führen wir Transkriptomanalysen durch, um das Regulon jedes zentralen Kompetenzregulators zu charakterisieren. SigH und ComK1 sind beide essentiell für die Aktivierung natürlicher Transformationsgene, aber auch wichtig für die Aktivierung oder Unterdrückung peripherer Funktionen. Obwohl ComK2 für die Kontrolle von Transformationsgenen nicht wichtig ist, zeigt sein Regulon eine wichtige Überlappung mit dem von SigH und ComK1. Abschließend schlagen wir vor, dass mikroaerobe Bedingungen, die vom SrrAB-Zweikomponentensystem erfasst werden, der Schlüssel zur Aktivierung der Kompetenz bei S. aureus sind.

Ein äußerst anpassungsfähiger kommensaler Organismus wie Staphylococcus aureus verfügt über eine Reihe von Genen, die es dem Bakterium ermöglichen, in einer Vielzahl ökologischer Nischen zu wachsen, zu infizieren und zu überleben. Die vorderen Nasenlöcher gelten im Allgemeinen als die heimische ökologische Nische von S. aureus, obwohl das Bakterium auch aus anderen Bereichen des menschlichen Körpers, einschließlich der Haut, den Achselhöhlen, der Leistengegend und dem Magen-Darm-Trakt, isoliert werden kann1. Während die Kolonisierung normalerweise nicht schädlich ist, kann S. aureus die angeborene Abwehr des Wirts durchbrechen und sich Zugang zu tieferen Geweben verschaffen, was zu einer Vielzahl oberflächlicher und invasiver Infektionen führt2. Darüber hinaus hat S. aureus als fakultativer Anaerobier die Fähigkeit, in Gegenwart oder Abwesenheit von Sauerstoff zu wachsen und das Immunsystem des Wirts zu beeinträchtigen. Diese Fähigkeit ist besonders wichtig für S. aureus, da bekannt ist, dass seine Umgebung im Verlauf einer Infektion anaerob ist oder wird3,4.

Zusätzlich zu diesen bemerkenswerten Anpassungsfähigkeiten wurde S. aureus auch zu einem der am meisten gefürchteten Krankheitserreger im Krankenhaus, da multiresistente Stämme gegen Antibiotika weit verbreitet waren5,6. Der horizontale Gentransfer (HGT) von Antibiotikaresistenzgenen aus anderen S. aureus-Stämmen oder sogar aus anderen Gattungen wurde jahrelang ausschließlich durch Konjugation und Transduktion vermittelt7. Vor einigen Jahren veränderte jedoch der Nachweis, dass S. aureus in der Lage ist, auf natürliche Weise für die genetische Transformation zuständig zu werden8, unsere Sichtweise auf HGT bei diesem wichtigen menschlichen Krankheitserreger.

Kompetenz ist eine physiologische Anpassung, die einige Bakterienarten als Reaktion auf verschiedene Umweltsignale entwickeln9. Als Reaktion auf diese Reize lösen Bakterienzellen Signaltransduktionswege aus und aktivieren so letztlich zentrale Kompetenzregulatoren. Alle diese Schritte werden von den sogenannten frühen Kompetenzgenen gesteuert. Interessanterweise wurden in mehreren Modellorganismen zentrale Kompetenzregulatoren als Transkriptionsaktivatoren10,11 oder alternative Sigma-Faktoren12 identifiziert. Sobald sie aktiviert sind, initiieren sie die Expression der späten Kompetenzgene, darunter alle für die genetische Transformation wesentlichen Gene.

Wichtig ist, dass in S. aureus drei potenzielle zentrale Kompetenzregulatoren identifiziert wurden: der alternative Sigma-Faktor SigH13 und zwei Transkriptionsregulatoren ComK1 und ComK214. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass S. aureus in einem chemisch definierten Medium namens CS28 auf natürliche Weise Kompetenz induzieren kann. Die Autoren erkannten nach 8-stündigem Wachstum im CS2-Medium maximal 1,6 % kompetenzinduzierende Zellen, was zu Transformationseffizienzen führte, die kaum die Nachweisgrenze (ca. 10–10) für einen Wildtyp-Stamm erreichten8.

In dieser Studie bestand unser Hauptziel darin, die Entwicklung der Kompetenz im Umgang mit dem menschlichen Krankheitserreger S. aureus zu charakterisieren. Unser Ziel war es, alle beteiligten Schritte zu untersuchen, von den von den Zellen wahrgenommenen Umweltreizen über die Signaltransduktionswege bis hin zu den zentralen Kompetenzregulatoren und ihren Regulons. Um diese Ziele zu erreichen, haben wir zunächst ein Protokoll entwickelt, um die Kompetenzentwicklung und genetische Transformation in planktonischen S. aureus-Kulturen zu optimieren. Anschließend analysierten wir mithilfe verschiedener Reporterstämme und einer globalen Transkriptomanalyse die Rolle der drei zentralen Regulatoren während der Kompetenzentwicklung bei S. aureus. Wir haben insbesondere gezeigt, dass SigH und ComK1 zwar beide für die Expression der an der genetischen Transformation beteiligten Gene essentiell sind, die drei Regulatoren (SigH, ComK1 und ComK2) jedoch alle für die vollständige Entwicklung des Kompetenztranskriptionsprogramms erforderlich sind. Abschließend schlagen wir vor, dass die vom SrrAB-Zweikomponentensystem (TCS) erfasste Sauerstofflimitierung, die wahrscheinlich SigH aktiviert, die Kompetenzentwicklung im menschlichen Pathogen S. aureus steuert.

Wir beschlossen zunächst, das von Morikawa und seinen Kollegen im Jahr 20128 veröffentlichte Protokoll zu optimieren (Einzelheiten siehe Material und Methoden). Um unsere Ergebnisse zu vergleichen, verwendeten wir denselben Reporterstamm, der das gfp-Gen unter der Kontrolle des Promotors des comG-Late-Competence-Operons (PcomG-gfp)8 exprimierte. Kurz gesagt, der Reporterstamm wurde zunächst auf einer BHI-Agaroseplatte ausgestrichen. Anschließend werden isolierte Kolonien verwendet, um eine Vorkultur im BHI-Medium anzuimpfen. Das exponentielle Wachstum dieser Vorkultur wurde dann schnell gestoppt, zentrifugiert, gewaschen und zum Animpfen einer frischen Kultur in ein CS2-Medium verwendet. Aus dieser Anfangskultur in frischem CS2 wurden zehnfache Reihenverdünnungen in geschlossenen Falcon-Röhrchen hergestellt. Schließlich wurden die Zelldichte (OD600 nm) und der Prozentsatz kompetenter GFP-exprimierender Zellen alle 30 Minuten durch Durchflusszytometrie in jeder verdünnten Kultur gemessen. Interessanterweise zeigt Abb. 1a, b, wie unser optimiertes Protokoll in einem bestimmten Experiment die Kompetenzentwicklung bei bis zu 70 % der Bevölkerung induzieren konnte (in Wirklichkeit schätzte die statistische Analyse diesen Prozentsatz auf 52 ± 15 % der Bevölkerung ein). n = 12). Dieser Prozentsatz, der mehr als zehnmal höher ist als in der Literatur, wurde zuvor durch den Nachweis GFP-exprimierender Zellen mittels Mikroskopie berechnet8. Daher haben wir überprüft, dass mittels Durchflusszytometrie durchgeführte Messungen keine Verzerrung hervorrufen und ähnliche Ergebnisse wie die Mikroskopie liefern (ergänzende Abbildung 1).

a Wachstum eines Wildtyp-Stammes, der GFP unter der Kontrolle des comG-Promotors (St29) in CS2-Medium exprimiert, zwischen 16 und 21,5 Stunden. Dargestellt sind Verdünnungen von 10−2 bis 10−5. Die 10-2-Verdünnung befand sich bereits in der stationären Phase, während die 10-3-Verdünnung nach 16 Stunden Wachstum in die stationäre Phase eintrat. Die 10–4- bzw. 10–5-Verdünnungen befanden sich zu Beginn des Experiments in der späten bzw. frühen exponentiellen Phase. Alle Verdünnungen erreichten eine ähnliche End-OD zwischen 2,4 und 2,6. b Der Prozentsatz kompetenter Zellen wurde mithilfe der Durchflusszytometrie gemessen, indem der Prozentsatz der Zellen analysiert wurde, die GFP unter der Kontrolle des comG-Promotors (PcomG) exprimierten. In jeder in Panel a) dargestellten verdünnten Kultur stieg der Prozentsatz kompetenter GFP-exprimierender Zellen in der späten exponentiellen Phase an und erreichte beim Eintritt in die stationäre Phase ein Maximum. Diese Grafik zeigt ein repräsentatives Experiment, das dreimal wiederholt wurde (biologische Replikate, siehe ergänzende Abbildung 2a). c Transformationseffizienzen der Mutantenstämme Wildtyp (N315ex ohne Phi), comGA (St137), sigH (St45), comK1 (St37), comK2 (St38) und srrA (St117) unter Verwendung von Plasmidstämmen (pCN34, KanR, weiße Balken). ) oder chromosomale DNA (graue Balken) (Einzelheiten siehe Material und Methoden). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Für jeden Stamm wurde das Experiment mindestens fünfmal wiederholt (biologische Replikate). Einzelne Experimente werden als blaue Kreise dargestellt. d Transformationseffizienzen von Laborstämmen (N315, RN4220 und USA300) und klinischen MRSA- (NL10, NL27) oder MSSA- (NL36) Isolaten unter Verwendung chromosomaler DNA (graue Balken) (Einzelheiten siehe Material und Methoden). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Für jeden Stamm wurde das Experiment mindestens fünfmal wiederholt (biologische Replikate). Einzelne Experimente werden als blaue Kreise dargestellt.

Anschließend bestätigten wir, dass unser optimiertes Protokoll, verbunden mit einer verbesserten Kompetenzentwicklung, auch zu einer höheren Transformationseffizienz führte. Interessanterweise erreichte ein N315-Wildtyp-Stamm unter Laborbedingungen eine Transformationseffizienz von etwa 1,5 × 10–7 (±0,6 × 10–8) mit einem replikativen Plasmid als Donor-DNA (Abb. 1c). Ein solches Ergebnis ist 1000-mal höher als das, was bisher veröffentlicht wurde8. Wichtig ist, dass die Transformationseffizienz sogar 4,2 × 10–6 (± 4,1 × 10–6) erreichte, wenn wir ein Chromosom des S. aureus-Stammes (das einen Antibiotika-Marker enthielt, siehe Material und Methoden) als exogene DNA verwendeten (Abb. 1c). Um definitiv zu bestätigen, dass es sich bei den in unseren Tests wachsenden Kolonien um echte Transformanten handelte, zeigten wir auch, dass mit einem Stamm, in dem comGA, ein essentielles Gen für die genetische Transformation15, deletiert wurde, keine Transformationsereignisse nachgewiesen werden konnten (Abb. 1c).

Wichtig ist, dass das hier beschriebene und für den N315-Stamm optimierte Protokoll auch andere Laborstämme (RN4220 und USA300) und klinische Isolate (NL10, NL27 und NL36) zur genetischen Transformation führt (Abb. 1d). Interessanterweise zeigte RN4220 sehr hohe Transformationseffizienzen (erreichte 9,7 × 10−5 ±5,9 × 10−5), während USA300 (7 × 10−8 ±6,9 × 10−8) und die klinischen Isolate (NL10, 1,2 × 10−7 ± 3,79 × 10–7; NL27, 1,6 × 10–7 ±4,8 × 10–7 und NL36, 1,2 × 10–7 ±7,9 × 10–7) zeigten niedrigere Zahlen als N315. Diese Ergebnisse zeigen deutlich die Robustheit unseres Protokolls, zeigen aber auch, dass für neue Stämme möglicherweise eine weitere Optimierung erforderlich ist.

Abbildung 1 zeigt deutlich, wie mithilfe unseres optimierten Protokolls in jeder verdünnten Kultur Kompetenz induziert wurde. Jede weitere Verdünnung war durch eine Wachstumsverzögerung von 2 Stunden gekennzeichnet (Abb. 1a). Tatsächlich benötigt die 10-5-Verdünnung mehr Zeit, um die stationäre Phase zu erreichen, als die 10-4-Verdünnung, die mehr Zeit benötigt als die 10-3-Verdünnung. Dementsprechend verzögerte sich auch die Kompetenzentwicklung in jeder aufeinanderfolgenden verdünnten Kultur (Abb. 1b). GFP-exprimierende kompetente Zellen traten jedoch immer auf, wenn sich die Kulturen OD = 2 näherten, und erreichten ein Maximum, sobald jede Kultur in die stationäre Phase eintrat (Abb. 1a, b).

Um die Existenz eines Zusammenhangs zwischen Kompetenzentwicklung und Zelldichte weiter zu überprüfen, haben wir dieses Experiment dreimal wiederholt (ergänzende Abbildung 2a). Diese Korrelation zeigte deutlich, dass die Kompetenzentwicklung bei in CS2 gezüchtetem S. aureus ein Maximum erreichte, als die Kulturen mit einer OD600 nm um 2,4 (tatsächlich zwischen 2,2 und 2,6) in die stationäre Phase eintraten (ergänzende Abbildung 2a). Eine hohe Zelldichte, die von Bakterienzellen durch Quorum Sensing (QS) wahrgenommen wird, wurde in mehreren Modellorganismen als wichtiger Stress vorgeschlagen und verifiziert, der Kompetenz induziert16,17,18. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass ein QS-System an der Kompetenzentwicklung bei S. aureus beteiligt sein könnte. Interessanterweise wurden in S. aureus zwei QS-Systeme identifiziert (Agr und Lux19). Daher untersuchten wir schließlich den Einfluss der Deletion der Gene agrA (kodiert für den Transkriptionsregulator des Agr-Systems19) und luxS (kodiert für den Regulator des Lux-Systems,19) auf die Kompetenzentwicklung. Überraschenderweise war keines dieser Gene an der Induktion der Expression des comG-Operons beteiligt (ergänzende Abbildung 2b). Dieses Ergebnis schien überraschend, insbesondere im Vergleich zu neueren Daten, bei denen die Streichung von agrAC die Kompetenz um das Dreifache verringerte20. Auch wenn sich die in dieser Studie verwendeten Protokolle von unseren unterscheiden, sind weitere Untersuchungen erforderlich, um zu verstehen, warum QS nicht bei allen Erkrankungen beteiligt zu sein scheint.

Wie in der Einleitung erwähnt, wurden in der Literatur drei potenzielle Kompetenzregulatoren identifiziert. Auch wenn sich gezeigt hat, dass SigH für die Aktivierung der Expression von PcomG8 wichtig ist, wurde ComK1 und ComK2 keine eindeutige Rolle zugewiesen. Hier haben wir uns entschieden, mithilfe unseres optimierten Protokolls die Auswirkung der Deletion von sigH, comK1 und comK2 auf die Expression von vier Promotoren zu testen: PcomG (ein Promotor, der nur durch SigH-Überexpression aktiviert wird,8,14), Pssb (ein Promotor, der nur aktiviert werden konnte). werden durch Überexpression von ComK1 aktiviert14), PcomC und PcomF (zwei Promotoren, die von keinem Regulator aktiviert werden konnten14).

Wie erwartet wurden die vier Promotoren vor einem Wildtyp-Hintergrund mit einem durchschnittlichen Prozentsatz an GFP-exprimierenden Zellen von 51,87 % für PcomG, 77,26 % für Pssb, 38,32 % für PcomC und 38,56 % für PcomF aktiviert gefunden (Abb. 2 und). Ergänzende Abbildung 3). Als sigH gelöscht wurde, ging nur der Ausdruck von PcomG verloren (Abb. 2a). Dieses Ergebnis bestätigt, dass SigH nicht die Expression aller genetischen Transformationsgene kontrolliert und dass mindestens ein zusätzlicher Regulator beteiligt sein muss. Interessanterweise wurde bei der Inaktivierung von comK1 die Expression aller Promotoren abgeschafft (Abb. 2a – d). Daher ist ComK1 neben SigH für die comG-Operon-Expression essentiell, aber auch allein für die ssb- und comC-Expression unbedingt erforderlich. Interessanterweise schien die comF-Regulierung mittelschwer zu sein, da die Deletion von comK1 die comF-Expression aufhebt, während das Fehlen von sigH sie um fast das Doppelte verringert (Abb. 2d). Schließlich konnte in einer comk2-Mutante kein Effekt für alle Promotoren festgestellt werden.

Prozentsatz der Bevölkerung, die GFP unter der Kontrolle von PcomG (St29, St51, St40 und St 41) (a), Pssb (St50, St61, St64 und St67) (b), PcomC (St48, St60, St63 und St66) exprimiert ) (c) und PcomF (St233, St235, St234 und St236) (d) in einem Wildtyp-Hintergrund oder in Abwesenheit von sigH, comK1 oder comK2 wurde nach 21 Stunden Wachstum in CS2-Medium bestimmt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Jedes Experiment wurde mindestens fünfmal wiederholt (biologische Replikate). Einzelne Experimente werden als blaue Kreise dargestellt.

Um unsere Ergebnisse zu vervollständigen (Abb. 2) und die SigH-, ComK1- und ComK2-Regulons umfassend zu charakterisieren, führten wir anschließend eine globale Transkriptionsanalyse durch RNA-Sequenzierung durch, indem wir die Auswirkungen der Deletion der für diese drei einzelnen Regulatoren kodierenden Gene auf die Kompetenz verglichen Transkriptionsprogramm.

Zunächst konzentrierten wir uns auf die Gene, die an der natürlichen genetischen Transformation beteiligt sind (Abb. 3 und Ergänzungstabelle 1). Die zuvor erzielten Ergebnisse wurden trotz einiger kleiner Unterschiede bestätigt (siehe Ergänzende Anmerkung 1). Insgesamt erwiesen sich sowohl SigH als auch ComK1 als essentiell für die Expression der meisten genetischen Transformationsgene, mit Ausnahme von ssb, das nur durch ComK1 kontrolliert wird. Auch hier konnte ComK2 keine Rolle zugeschrieben werden. Schließlich überprüften wir die Transformationseffizienz von Stämmen, bei denen die Gene, die für die zentralen Kompetenzregulatoren kodieren, einzeln gelöscht wurden (Abb. 1c). Erwartungsgemäß wurde die genetische Transformation nur durch das Fehlen von sigH oder comK1 aufgehoben, während eine comK2-Mutante eine Transformationseffizienz zeigte, die mit der eines Wildtyp-Stammes vergleichbar war (Abb. 1c).

Gene für späte Kompetenz, deren Expression induziert (>2-fach, a) oder unterdrückt (>2-fach, b) ist. Jeder farbige Kreis stellt ein Regulon dar, dessen Expression durch SigH (in Blau), ComK1 (in Gelb), ComK2 (in Grün) oder durch die drei (außerhalb des schwarzen Kreises) aktiviert oder gehemmt wird. Die Anzahl der Gene in jeder Kategorie wird innerhalb der Kreise oder am Schnittpunkt zwischen den Kreisen angezeigt, wenn dasselbe Gen von mehr als einem Regulator kontrolliert wird. Die folgende Tabelle zeigt die Gesamtzahl der Gene, deren Expression durch einen zweifachen, dreifachen oder fünffachen Faktor induziert oder unterdrückt wird. Pro Funktion werden auch aktivierte (c) und unterdrückte (d) Spätkompetenzgene (>2-fach) dargestellt. Die Anzahl der Gene, die von jedem zentralen Kompetenzregulator kontrolliert werden (SigH in Blau, ComK1 in Gelb und ComK2 in Grün), wird innerhalb der Kreise oder am Schnittpunkt zwischen den Kreisen angezeigt, wenn dasselbe Gen von mehr als einem Regulator kontrolliert wird.

In anderen Modellorganismen umfasst das Kompetenztranskriptionsprogramm immer mehr Gene als nur die Gene, die an der genetischen Transformation beteiligt sind21,22,23,24. Dies ist eindeutig auch bei S. aureus der Fall. Tatsächlich wurde im Vergleich zu den Mutantenstämmen sigH, comK1 und comK2 festgestellt, dass 213/73/95 Gene jeweils um mindestens einen zweifachen Faktor im Wildtyp-Stamm überexprimiert waren (Abb. 3a). Wenn wir darüber hinaus höhere Grenzwerte für die Überexpression in Betracht ziehen, ist die Anzahl der überexprimierten Gene immer noch wichtig, wobei 84/38/53 Gene um einen dreifachen Faktor überexprimiert werden und sogar 35/23/31 Gene um einen fünffachen Faktor überexprimiert werden . Die hier gefundenen Zahlen, insbesondere für den dreifachen Expressionsfaktor, ähneln denen, die in anderen Modellorganismen beschrieben wurden21,22,23,24, und zeigen einen echten Kernsatz von etwa 100 Spätkompetenzgenen in S. aureus.

Anschließend analysierten wir die Funktionen, die mit den Genen verbunden sind, die während des S. aureus-Kompetenztranskriptionsprogramms induziert werden (Abb. 3c, Ergänzungstabellen 2–4). Zusätzlich zu den natürlichen genetischen Transformationsgenen fanden wir Gene, die an (i) der Regulierung der Stressreaktion beteiligt sind (hauptsächlich, aber nicht ausschließlich, kontrolliert durch ComK2), (ii) Genen, die für mehrere mutmaßliche Toxin-/Antitoxinsysteme25 kodieren (kontrolliert durch die drei Regulatoren). ), (iii) Gene, die am Amino- und Nukleinsäurestoffwechsel beteiligt sind (kontrolliert durch SigH und ComK2) und (iv) Gene, die am Eisentransport beteiligt sind (hauptsächlich, aber nicht ausschließlich kontrolliert durch SigH). Wichtig ist, dass unsere Ergebnisse eindeutig gezeigt haben, dass, obwohl nur SigH und ComK1 für die Expression der genetischen Transformationsgene essentiell sind, die zentralen Kompetenzregulatoren (d. h. SigH, ComK1 und ComK2) alle für die vollständige Entwicklung der Transkriptionskompetenz unbedingt erforderlich sind Programm in S. aureus.

Unsere globale Transkriptionsanalyse ergab außerdem, dass die Expression zahlreicher Gene während der Kompetenzentwicklung in S. aureus gehemmt wurde. Tatsächlich fanden wir heraus, dass im Wildtyp-Stamm im Vergleich zu den einzelnen Mutantenstämmen sigH, comK1 oder comK2 insgesamt 399 Gene gehemmt waren (>2-fach) (Abb. 3b). Dies stellt mehr als 15 % aller Gene dar, die im Genom von N315 S. aureus vorhanden sind.

Interessanterweise sind mehr als 10 % der unterdrückten Gene (genauer gesagt 37) direkt an der Virulenz oder Virulenzregulation beteiligt (Abb. 3d, Ergänzungstabelle 5). Unter diesen Genen wurden viele gut charakterisierte Virulenzfaktoren gefunden, darunter Gene, die für die Kapsel (CapA-O), Serinproteasen (SplA-F, SspA-C), interzelluläre Adhäsine (IcaAB) und Exoproteine ​​(Hlg, Coa) kodieren Proteine ​​(ClfAB, fnb, FnbB, geh, sdrCD, Spa) und eine Lipase (Geh). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Expression eines wichtigen TCS, von dem bekannt ist, dass es die Expression von über 20 Virulenzfaktoren in vivo steuert, saeRS26, während der Kompetenz unterdrückt ist. Obwohl festgestellt wurde, dass alle zentralen Kompetenzregulatoren an der Virulenzrepression beteiligt sind, spielten SigH und ComK2 eine wichtige Rolle mit einer wichtigen Überlappung zwischen den Genen, die sie jeweils unterdrücken (Abb. 3d, Ergänzungstabelle 5). Leider zeigte ein Vergleich von Wildtyp- und sigH- oder comK2-mutierten Exoproteomen keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl der Virulenzfaktoren (ergänzende Abbildung 4). Wichtig ist, dass in unseren Kulturen zwei Populationen nebeneinander existieren, kompetente und nichtkompetente Zellen, die jeweils 50 % der Gesamtpopulation ausmachen. Da die nichtkompetenten Zellen weiterhin Virulenzfaktoren produzieren, würde daher die Wirkung der mit den kompetenten Zellen verbundenen Hemmung auf die Gesamtmenge der in der Kultur produzierten Virulenzfaktoren unterschätzt. Alternativ könnten die Zellen zu einem Zeitpunkt gesammelt worden sein, der für die Beobachtung der Wirkung auf das Exoproteom möglicherweise nicht geeignet ist.

Schließlich wurde die Kompetenzentwicklung bei S. aureus unter verschiedenen Bedingungen nachgewiesen, die mit unterschiedlicher Sauerstoffverfügbarkeit verbunden sind8. Daher haben wir uns gefragt, ob in S. aureus vorhandene sauerstoffempfindliche TCS (d. h. SrrAB27, NreBC28 und AirRS29) an den frühen Kompetenzregulierungsschritten im Verlauf des Planktonwachstums im CS2-Medium beteiligt sind. Um eine solche Hypothese zu testen, verglichen wir die Expression des comG-Promotors in Wildtyp- und srrA-, nreC- und airR-Mutantenstämmen. In diesem Experiment hatte die Deletion von nreC und airR keinen Einfluss auf die Expression des comG-Promotors (Abb. 4a). Wenn jedoch srrA fehlte, war die comG-Expression um den siebenfachen Faktor verringert (Abb. 4a). Da sowohl SigH als auch ComK1 an der comG-Operon-Expression beteiligt sind (Abb. 2a), haben wir uns dann entschieden, zu bestimmen, welcher zentrale Kompetenzregulator unter der Kontrolle von SrrAB stand. Da festgestellt wurde, dass die ssb-Expression nur von ComK1 gesteuert wird (Abb. 2b), haben wir abschließend die Auswirkung der srrA-Deletion auf ihre Expression getestet. In Abwesenheit von srrA wurde die Expression von ssb nicht beeinflusst (Abb. 4b). Darüber hinaus hatte die Deletion von sigH und srrA den gleichen Einfluss auf die ssb-Expression wie die einzelnen mutierten Stämme von sigH und srrA (Abb. 4b). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass SrrAB SigH aktivieren könnte, um die Expression des comG-Promotors zu steuern. Darüber hinaus impliziert die Bedeutung von SrrAB in den Regulierungswegen, die zur Kompetenzentwicklung und genetischen Transformation führen, dass das Fehlen von srrA einen Einfluss auf die Effizienz der genetischen Transformation von S. aureus haben muss. Tatsächlich wurde bei der Löschung des srrA-Gens eine 15- bzw. 19-fache Abnahme (jeweils unter Verwendung von Plasmid- oder chromosomaler DNA erhalten) der genetischen Transformationseffizienz von S. aureus beobachtet (Abb. 1c).

a Prozentsatz der Zellen, die GFP aus PcomG in den Mutantenstämmen Wildtyp (St29), ssrA (St145), nreC (St158) und airR (St177) exprimieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Jedes Experiment wurde mindestens fünfmal wiederholt (biologische Replikate). Einzelne Experimente werden als blaue Kreise dargestellt. b Prozentsatz der Zellen, die GFP aus Pssb in den Stämmen Wildtyp (St50), srrA (St147), sigH (St61) und srrA/sigH-Doppelmutante (St252) exprimieren. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Jedes Experiment wurde mindestens fünfmal wiederholt (biologische Replikate). Einzelne Experimente werden als blaue Kreise dargestellt.

Sauerstoffempfindliches TCS ermöglicht es S. aureus, mikroaerobe oder anaerobe Bedingungen zu überwachen und darauf zu reagieren. Insbesondere hat sich gezeigt, dass SrrAB unter sauerstoffarmen Bedingungen ein globaler Regulator von Virulenzfaktoren ist27. Es ist daher verlockend zu spekulieren, dass während des S. aureus-Wachstums im CS2-Medium die Sauerstoffkonzentration in der Kultur abfiel. Um diese Hypothese zu testen, haben wir schließlich die Konzentration an gelöstem Sauerstoff während des gesamten Wachstums in CS2 gemessen (Abb. 5 und ergänzende Abb. 5). Interessanterweise sank die Sauerstoffkonzentration schnell, als die OD zuzunehmen begann. Während die Sauerstoffkonzentration in den ersten 8 Stunden konstant bei 21 % blieb, sank sie in den nächsten 6 Stunden auf 0,27 %, während die OD der Kultur nur 0,5 erreichte. Einige Minuten nachdem die Sauerstoffkonzentration ihren Tiefpunkt erreicht hatte, pausierte die Kultur reproduzierbar für etwa eine Stunde, möglicherweise um sich an diese neuen Bedingungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt anzupassen (Abb. 5). Nach dem Abfall der Sauerstoffkonzentration und der Wachstumspause begannen schließlich GFP-exprimierende kompetente Zellen zu entstehen (Abb. 5). Daher können wir zuversichtlich vorschlagen, dass bei Verwendung unseres optimierten Protokolls das Wachstum im CS2-Medium mit einer schnellen Einschränkung der Sauerstoffverfügbarkeit verbunden ist, was zu mikroaeroben Bedingungen führt, die von SrrAB erfasst werden, was wiederum SigH für die Induktion der Kompetenz in S. aureus aktiviert.

Ein Wildtyp-Stamm (St29), der GFP unter der Kontrolle von PcomG exprimiert, wurde 24 Stunden lang in einem CS2-Medium gezüchtet. Als das Wachstum nachweisbar wurde, wurden alle 30 Minuten die Sauerstoffkonzentration, der Prozentsatz der GFP-exprimierenden Zellen und die OD600 nm gemessen. Mit zunehmender OD sank die Sauerstoffkonzentration schnell von 21 % auf 0,27 %, während die OD nur noch 0,5 erreichte. Wichtig ist, dass wir mit unserem Test bestätigen können, dass keine vollständig anaeroben Bedingungen erreicht werden, da unsere Sensoren in der Lage sind, zehnmal niedrigere Sauerstoffkonzentrationen zuverlässig zu messen. Einige Minuten später markierte das Wachstum reproduzierbar eine Pause, die wahrscheinlich notwendig war, damit sich die Zellen an Bedingungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt anpassen konnten, was wiederum zu einem Anstieg des Prozentsatzes kompetenter GFP-exprimierender Zellen führte. Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment, das fünfmal reproduziert wurde (Replikationen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 5).

Zuvor hatte die Arbeit von Fagerlund und ihren Kollegen14 eindeutig gezeigt, dass die individuelle oder kombinierte Überexpression des zentralen Kompetenzregulators nicht ausreichte, um die volle Kompetenzentwicklung bei S. aureus herbeizuführen. In dieser Studie stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das die optimale Induktion der genetischen Kompetenz bei S. aureus ermöglicht. Dieses Protokoll war für die Durchführung der hier vorgeschlagenen genetischen Studie von wesentlicher Bedeutung. Wichtig ist, dass die resultierenden Transformationseffizienzen, die bei mehreren Laborstämmen und klinischen Isolaten festgestellt wurden, letztendlich das wahre Potenzial dieses HGT-Mechanismus zur Modulierung der genetischen Plastizität von S. aureus und des Erwerbs von Antibiotikaresistenzgenen in vivo zeigen.

Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass drei zentrale Kompetenzregulatoren für eine vollständige Entwicklung des Kompetenztranskriptionsprogramms in S. aureus unerlässlich sind. Während die Bedeutung von SigH bereits bekannt war, zeigen wir zum ersten Mal die Essenz von ComK1 für die Expression der an der genetischen Transformation beteiligten Gene. Wichtig ist auch, dass wir zeigen, wie ComK2 neben SigH und ComK1 an der vollständigen Entwicklung des Kompetenztranskriptionsprogramms beteiligt ist (Abb. 6). Tatsächlich zeigt unsere globale transkriptomische Studie deutlich, dass neben der genetischen Transformation auch zahlreiche andere Funktionen während der Kompetenz induziert werden, ein Merkmal, das mit anderen Modellorganismen geteilt wird. In Zukunft wird es wichtig sein zu untersuchen, wie diese anderen biologischen Prozesse (z. B. Stressreaktion30, Amino-31 und Nukleinsäure-32-Stoffwechsel oder Toxin-/Antitoxinsysteme33,34) an der Etablierung der Kompetenz zur Anpassung an die Umwelt beteiligt sind.

Es wurden drei zentrale Kompetenzregulatoren identifiziert, nämlich SigH, ComK1 und ComK28,14. Alle drei Regulatoren sind für eine vollständige Entwicklung des Kompetenztranskriptionsprogramms von wesentlicher Bedeutung. Während SigH und ComK1 für die Expression genetischer Transformationsgene unbedingt erforderlich sind, ist ComK2 (neben SigH und ComK1) auch für die Induktion zusätzlicher zellulärer Funktionen (z. B. Stressreaktion, Toxin-/Antitoxin-Systeme, Amino- und Nukleinsäurestoffwechsel, Eisen) essentiell Transport…). Darüber hinaus ist die Kompetenzentwicklung durch die Hemmung der Virulenz gekennzeichnet, die hauptsächlich durch SigH und ComK2 gesteuert wird. Schließlich haben wir gezeigt, dass die natürliche Kompetenzentwicklung dadurch induziert wird, dass die Sauerstoffkonzentration in der Kultur drastisch sinkt. Diese Sauerstoffverdünnung wird wahrscheinlich vom Zweikomponentensystem SrrAB erfasst, das wiederum den zentralen Kompetenzregulator SigH aktiviert.

Ein auffälliges Merkmal ist das Vorhandensein und die Beteiligung von drei zentralen Kompetenzregulatoren in S. aureus, die wahrscheinlich jeweils durch unterschiedliche Signaltransduktionswege induziert werden. Ein weiteres Problem ist die Überlappung der SigH-, ComK1- und ComK2-Regulons, auch wenn eine solche Überlappung bereits bei Vibrio cholerae beschrieben wurde, bei dem zwei zentrale Kompetenzregulatoren identifiziert wurden35. Eine Hypothese könnte sein, dass S. aureus mehrere Regulierungswege benötigt, um ein breiteres Spektrum an Hinweisen zu integrieren und zu entscheiden, ob er für die genetische Transformation kompetent wird oder nicht. Dieser Hypothese zufolge sollten mehrere Umweltsignale gleichzeitig vorhanden sein, um die optimale Entwicklung der genetischen Kompetenz bei S. aureus zu ermöglichen. Andererseits bietet eine solch komplexe globale Regulierung mehrere Ziele zur Modulation der Kompetenzentwicklung, wenn sich S. aureus nicht in diesen optimalen Bedingungen befindet. Interessanterweise könnte ComK2, das die Expression der genetischen Transformationsgene in mikroaeroben Umgebungen nicht kontrolliert, als Reaktion auf verschiedene spezifische Umweltsignale beteiligt werden und die Regulierung der Kompetenzentwicklung bei S. aureus komplex machen.

Darüber hinaus ist es interessant zu erwähnen, dass die Regulierung der Kompetenzentwicklung bei S. aureus Merkmale mit mehreren wichtigen historischen Modellorganismen teilt: S. pneumoniae und sein alternativer Sigma-Faktor (ComX), der SigH13 phylogenetisch nahe steht, B. subtilis und seine zentrale Kompetenz Regulator, ComK, homolog zu ComK1 und ComK214 und V. cholerae durch das Vorhandensein mehrerer zentraler Kompetenzregulatoren18. Daher wäre es interessant und wahrscheinlich wichtig, in Zukunft zu testen, ob andere regulatorische Merkmale, die in diesen historischen Modellorganismen vorhanden sind, von S. aureus auch zur Steuerung oder Modulation der Kompetenzentwicklung genutzt werden könnten.

Abschließend zeigen wir, wie eine Sauerstoffeinschränkung, die zu mikroaeroben Bedingungen führt, die vom SrrAB TCS erfasst werden, die Kompetenzentwicklung bei S. aureus steuert. Da unsere Kulturen in geschlossenen Röhrchen durchgeführt werden, ähnlich wie zuvor veröffentlicht36, gehen wir davon aus, dass das Wachstum von S. aureus in CS2 zu einem schnellen Verbrauch von gelöstem Sauerstoff führt, der nicht durch Luftsauerstoff ersetzt werden kann. Ergebnisse aus der Literatur deuteten bereits darauf hin, dass S. aureus die Fähigkeit besitzt, unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen Kompetenz zu induzieren8,20. Die Induktion von Kompetenz unter anaeroben Bedingungen8, während der Biofilmbildung20 oder als Reaktion auf ROS37 untermauert diese Idee weiter. Wir schlugen auch vor, dass SrrAB SigH (durch Transkription, Translation oder Stabilität) als Reaktion auf Schwankungen der Sauerstoffkonzentration in der Umgebung aktivieren könnte. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um vollständig zu verstehen, wie eine Abnahme der Sauerstoffkonzentration direkt oder indirekt SigH durch SrrAB aktiviert. Interessanterweise zeigt die Arbeit von Cordero und Kollegen, wie Kompetenzentwicklung mit dramatischen Veränderungen im Kohlenstoffstoffwechsel verbunden ist37. Daher wäre es wichtig zu testen, ob die Regulierung der Zellphysiologie als Reaktion auf Sauerstoffbeschränkungen an der Kompetenzentwicklung bei S. aureus beteiligt sein könnte.

Wichtig ist, dass S. aureus in vivo häufig mikroaerobe Bedingungen antrifft. Tatsächlich lösen während einer Infektion energieverbrauchende aktivierte Neutrophile Sauerstoffmangel aus, während Makrophagen, dendritische Zellen und T-Zellen Entzündungen auslösen, die Durchblutung des Gewebes verändern und den Sauerstoffgehalt drastisch senken38. Darüber hinaus bilden sich bei Biofilm-assoziierten Infektionen39 oder Abszessen40 sauerstoffarme Mikroumgebungen. Daher ist S. aureus im Verlauf einer Infektion häufig den in diesem Manuskript beschriebenen Umweltbedingungen ausgesetzt, was zur Entwicklung der Kompetenz zur genetischen Transformation führt und das wahre Potenzial dieses HGT-Modus in vivo verstärkt. Unsere globale transkriptomische Analyse ergab jedoch auch, dass die Transkription zahlreicher Virulenzgene während der natürlichen Kompetenzentwicklung unterdrückt wurde (Abb. 6). Daher können wir als In-vivo-Modell vorschlagen, dass S. aureus-Zellen im Verlauf einer Infektion die Expression des Virulenzregulons induzieren, was letztendlich zu einem lokalen Sauerstoffmangel führen würde. Ein begrenzter Prozentsatz der Bevölkerung nimmt dann dieses Umweltsignal wahr und induziert als Reaktion darauf die Kompetenz zur genetischen Transformation in einem begrenzten Teil der Bevölkerung. Letztendlich unterdrücken die kompetenten S. aureus-Zellen die Virulenz und fördern die HGT, während der Rest der Bevölkerung die Infektion weiterhin fördert.

Die S. aureus-Stämme N3158, RN422041 und USA30042 sowie die in diesem Projekt verwendeten klinischen Isolate43 sind alle in der Ergänzungstabelle 6 aufgeführt. S. aureus-Stämme wurden in BHI-Medium (Becton, Dickinson und Company) oder einem vollständig synthetischen Medium gezüchtet Medium namens CS28, je nach Experiment. Bei Bedarf wurden Antibiotika eingesetzt, um bestimmte Ereignisse auszuwählen (Kan, 200 µg/ml; Cm, 10 µg/ml).

Die Zellen wurden aus Stammlösung bei –80 °C auf der BHI-Platte isoliert. Vier Klone wurden in 10 ml BHI inokuliert und bei 37 °C unter Schütteln bei 180 U/min inkubiert, bis die OD 2,5 erreichte. Diese Vorkultur wurde dann zentrifugiert, in frischem CS2-Medium gewaschen und zum Animpfen von 10 ml frischem CS2-Medium (OD = 0,5) in geschlossenen 50-ml-Falcon-Röhrchen verwendet. Von dieser anfänglichen CS2-Kultur wurden serielle 10-fache Verdünnungen durchgeführt, um 10−1-, 10−2-, 10−3-, 10−4- und 10−5-Kulturen mit geschlossenen 50-ml-Falcon-Röhrchen und bei Bedarf mehr zu erzeugen. Für jede Verdünnung wurden mehrere Röhrchen vorbereitet, um einzelne Proben während des Wachstums zu entnehmen (dh jedes Falcon-Röhrchen wurde nur einmal für eine Probe geöffnet). Die Verdünnungen wurden schließlich über Nacht bei 37 °C unter Schütteln bei 120 U/min inkubiert. Die Zellen wurden gesammelt, wenn die OD zwischen 2 und 2,2 lag (GFP-Reporterstämme, Abb. 2 und 3) oder während des gesamten Wachstums (GFP-Reporterstämme, Abb. 1, Sauerstoffmessungen, Abb. 4).

Die interessierenden Promotoren wurden mithilfe der Gibson-Assemblierungsmethode in das pRIT-GFP-Plasmid44 eingefügt. Die Promotoren und das pRIT-GFP-Plasmid wurden zunächst mit speziellen Primern amplifiziert. Alle in dieser Studie verwendeten Oligonukleotide sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. Im Schwanz jedes Primers haben wir homologe Überlappungsregionen von 25–50 bp zwischen den Enden jedes Promotors und dem linearen pRIT-GFP-Plasmid entworfen. Die Promotoren und das pRIT-GFP-Plasmid wurden mit der Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (erworben von Thermo Scientific) amplifiziert. Alle PCR-Fragmente wurden dann mit einer handelsüblichen Silikonsäule (PCR Cleanup Kit, Macherey-Nagen) gereinigt und durch Gelelektrophorese auf die Abwesenheit unspezifischer oder geringfügiger PCR-Fragmente überprüft.

Der Gibson-Assembly-Mastermix wurde durch Zugabe von 320 µL 5× ISO-Puffer (25 % w/v PEG-8000; 500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 50 mM DTT; 5 mM NAD; jeweils 1 mM dNTP) hergestellt ), 0,64 µL 10 U/µL T5-Exonuklease, 20 µL 2 U/µL Phusion-Polymerase, 160 µL 40 U/µL Taq-DNA-Ligase und 699,36 µL Wasser (alle Reagenzien wurden von New England Biolabs gekauft). Fünf Mikroliter der Mischung aus zwei DNA-Fragmenten, die 100 ng lineares pRIT-Plasmid und einen dreifachen Überschuss an Inserts enthielt, wurden zu 15 µL Gibson-Assembly-Master-Mix hinzugefügt. Die Reaktionsröhrchen wurden dann 1 Stunde lang bei 50 °C inkubiert. Schließlich wurde 1 µL der Assemblierungsreaktion in elektrokompetente IM08B-Escherichia-coli-Zellen transformiert. Transformierte E. coli-Zellen wurden bei 37 °C auf LB-Agar mit 100 µg/ml Ampicillin inkubiert.

Um die Transformanten auszuwählen, die das erwartete Plasmid enthalten, wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Die resultierenden Plasmide wurden aus positiven Transformanten (Übernachtkulturen) extrahiert und mit einem kommerziellen Kit (NucleoSpin Plasmid Extraction Kit, Macherey-Nagen) gereinigt. Alle Plasmide wurden durch Sequenzierung verifiziert (Firma GATC). Um schließlich die endgültigen Reporterstämme zu erhalten, wurden elektrokompetente S. aureus-Zellen mit jedem konstruierten Plasmid transformiert.

Um die Rolle der Hauptgene zu untersuchen, die voraussichtlich an der Regulierung der Kompetenzentwicklung in S. aureus beteiligt sind (siehe Tabelle S1), wurden Allelersatzkonstrukte in das temperaturempfindliche pIMAY-Plasmid kloniert44. Alle für die Klonierung in der vorliegenden Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt. Fragmente, die 1 kbp großen flankierenden Regionen der zu löschenden Gene entsprechen, wurden aus genomischer DNA von S. aureus N315 unter Verwendung von Primern amplifiziert, die von mit der Mehrfachklonierung kompatiblen Restriktionsenzymstellen flankiert waren Website (MCS) von pIMAY. Die stromaufwärts oder stromabwärts gelegenen Regionen wurden mit den beiden ausgewählten Restriktionsenzymen verdaut und in den mit denselben Enzymen geöffneten pIMAY ligiert. Die resultierenden Plasmide wurden elektrotransformiert in den Stamm IM08B E. coli. Anschließend wurde die Kolonie-PCR verwendet, um die Struktur der in den Transformanten vorhandenen Plasmide zu überprüfen. Plasmide wurden aus den positiven Kolonien unter Verwendung eines kommerziellen Kits (NucleoSpin Plasmid Extraction Kit, Macherey-Nagen) gereinigt. Nach Überprüfung der Sequenz des Plasmids (GATC-Unternehmen) wurde der Stamm S. aureus N315ex woϕ durch Elektroporation transformiert und auf BHI-Agar, ergänzt mit Chloramphenicol (10 mg/ml), ausplattiert und bei 28 °C inkubiert.

Um die Integration von pIMAY in das Chromosom zu ermöglichen, wurde eine einzelne Kolonie aus der Transformationsplatte in 200 µL BHI resuspendiert. Die Suspension wurde 10-fach auf 10–3 verdünnt und 100 µL jeder Verdünnung wurden auf BHI, ergänzt mit Chloramphenicol (10 mg/ml), verteilt und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Kolonien anschließend unter den gleichen Bedingungen ausgestrichen. In der Zwischenzeit wurde eine Kolonie-PCR-Analyse durchgeführt, um das Fehlen von extrachromosomalem pIMAY zu überprüfen und ob eine Plasmidintegration in der Upstream- oder Downstream-Region stattgefunden hatte.

Basierend auf den Kolonie-PCR-Ergebnissen wurde eine Übernachtkultur in BHI bei 28 °C ohne Chloramphenicol durchgeführt. Die Übernachtkultur wurde dann um das Zehnfache auf 10–7 verdünnt. Hundert Mikroliter von 10–4 bis 10–7 Verdünnungen wurden auf BHI mit 1 µg/ml Anhydrotetracyclin (aTc) ausplattiert. Die Platten wurden 2–3 Tage bei 28 °C inkubiert. Die Kolonien wurden dann auf BHI-Platten (ohne Antibiotikum) und mit Chloramphenicol (10 mg/ml) ergänztes BHI aufgetragen und über Nacht bei 37 °C gezüchtet. Chloramphenicol-empfindliche Kolonien wurden mittels Kolonie-PCR gescreent, um Klone zu identifizieren, die die gewünschte Mutation enthielten. Mutantenstämme wurden schließlich durch PCR und DNA-Sequenzierung verifiziert.

Nach dem Wachstum in CS2 wurden 500 µl Zellen durch einminütige Zentrifugation bei 11.000 g geerntet. Die Pellets wurden in 500 µl kaltem 70 %igem Ethanol resuspendiert und 20 Minuten auf Eis inkubiert, um die Zellen zu fixieren. Anschließend wurden S. aureus-Zellen nach einminütiger Zentrifugation bei 11.000 g in 500 µL PBS (pH 7,4) resuspendiert. Schließlich wurde der Prozentsatz der Bevölkerung, die GFP exprimierte, mittels Durchflusszytometrie (Cytoflex Top-Bench-Zytometer, Beckman-Coulter) bewertet. Nach der Vorwärts- und Seitenstreuerkennung zur Identifizierung einzelner Zellen wurde ein 488-nm-Laser verwendet, um GFP-exprimierende kompetente Zellen durch Vergleich mit der Autofluoreszenz eines Stamms zu unterscheiden, der kein GFP (St12) exprimierte (siehe ergänzende Abbildung 1a). ).

Es ist wichtig zu erwähnen, dass GFP ein sehr stabiles Protein ist. Sobald der maximale Prozentsatz an kompetenten Zellen erreicht war, blieb diese Zahl daher über Stunden hinweg konstant. Diese Funktion bedeutet nicht, dass die Kompetenz stundenlang „offen“ bleibt, sondern vielmehr, dass nach Erreichen des Maximums keine neuen kompetenten Zellen mehr erscheinen.

Nach dem Wachstum in CS2 wurden die Zellen geerntet und wie oben erläutert behandelt (siehe Durchflusszytometrie). Fluoreszenzbilder von Zellen wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (ImagerieGif-Plattform) aufgenommen. GFP wurde mit dem blauen Laser bei 488 nm angeregt und Fluoreszenzbilder wurden mit dem grünen Kanal aufgenommen. Die Bilder wurden mit der ImageJ-Software wiederhergestellt.

Der Wildtyp-Stamm (St12) sowie die Mutantenstämme comGA (St137), comK1 (St37), comK2 (St38) und sigH (St45) wurden zunächst mithilfe unseres optimierten Verdünnungsprotokolls bis zur Leistungsfähigkeit gezüchtet. Wir haben uns entschieden, die Transformationsexperimente mit der −2-Verdünnungskultur für jeden Stamm durchzuführen. Die Zellen wurden auf natürliche Weise nach dem zuvor veröffentlichten Protokoll8 mit einigen Anpassungen transformiert. Kurz gesagt, zu jedem Zeitpunkt (jede halbe Stunde) wurden 2 ml Zellen durch 1-minütige Zentrifugation bei 10.000 g und 4 °C geerntet, in 2 ml frischem CS2 resuspendiert und gleichmäßig auf zwei Röhrchen aufgeteilt. Ein oder 5 µg Spender-DNA (Plasmid oder Chromosom) wurden in eines der Röhrchen gegeben (das zweite Röhrchen dient als „keine DNA“-Kontrolle) und 2,5 Stunden lang bei 37 °C unter Rühren bei 180 U/min inkubiert. Zehn oder 100 µL (Röhrchen mit DNA) oder 1 ml („keine DNA-Kontrolle“) aus jedem Röhrchen wurden schließlich mit 25 ml geschmolzenem, auf 55 °C vorgekühltem BHI-Agar zusammen mit einem Antibiotikum gemischt und die Mischung hineingegossen Petrischalen. Nach der Verfestigung wurden die Platten 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Lebensfähigkeit auch durch Reihenverdünnung auf BHI-Agarplatten bewertet. Die Transformationseffizienzen wurden schließlich berechnet, indem die Anzahl der in 1 ml Kultur nachgewiesenen Transformanten durch die Gesamtzahl der Zellen im gleichen Volumen dividiert wurde. Die in Abb. 1c dargestellten Zahlen stellen den Mittelwert der höchsten Transformationseffizienzen dar, die während des Wachstums während jedes Experiments festgestellt wurden. Die Experimente wurden für jeden Stamm mindestens fünfmal wiederholt, um eine hohe statistische Relevanz zu gewährleisten.

Plasmid. Das pCN34-Plasmid (Kan45) wurde in einigen genetischen Transformationsexperimenten verwendet (Abb. 1c). pCN34 wurde aus dem Stamm St197 gereinigt. Kurz gesagt, 50 ml Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet und das Plasmid wurde mit einem Plasmid-Reinigungskit (Macherey-Nagen) gereinigt.

Chromosomale DNA. Stamm St294 wurde verwendet, um chromosomale Spender-DNA bereitzustellen (Abb. 1c, d). In St294 wurde das pIMAY-INT14-Plasmid (Cm) an der INT-Chromosomenstelle14 in das Chromosom eingefügt. Die Plasmidinsertion wurde durch PCR verifiziert, es konnte jedoch kein replizierendes Plasmid nachgewiesen werden. Kurz gesagt, 100 ml Kultur wurden zentrifugiert und in 5 ml TEG (Tris 5 mM, pH 8; EDTA, 10 mM; Glucose, 1 %) resuspendiert, ergänzt mit 500 µL Proteinase K (10 mg/ml), 2 ml Lyse Puffer (NaOH, 0,2 N; SDS, 1 %) und 20 g Glasperlen (Stratech, Nr. 11079-105, 0,5 mm Durchmesser). Die Zellen wurden dann unter Verwendung von 5 Wirbelzyklen (jeweils 1 Minute) aufgebrochen, wobei zwischen jedem Zyklus 1 Minute in Eis lag. Um die Zelllyse abzuschließen, wurden 3 ml Lysepuffer 5 Minuten lang bei Raumtemperatur zugegeben und mit 6 ml NaAc (3 M, pH 4,8) neutralisiert. Schließlich wurde die im Überstand vorhandene chromosomale DNA nach 2-stündiger Inkubation bei –20 °C mit 96 % Ethanol (1 ml EtOH für 500 µL Überstand) präzipitiert. Nach der Zentrifugation wurde die chromosomale DNA mit 300 µL kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen. Ausgefällte chromosomale DNA wurde schließlich in 300 µL Tris 5 mM, pH 8, resuspendiert.

Probenahme und Isolierung. Kulturen von S. aureus wurden in CS2-Medium bei 37 °C und 180 U/min gezüchtet, bis die OD600 2 erreichte. Um den Zellstoffwechsel/die Transkription zu stoppen und RNAs zu stabilisieren, wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 g für 1 Minute bei 4 °C geerntet Die Pellets wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren, bevor sie bei –80 °C gelagert wurden. Für jeden der vier Stämme wurden drei unabhängige biologische Replikate gesammelt (Wildtyp, St29; ΔcomK1, St40; ΔcomK2, St41; ΔsigH, St61). Zur Extraktion der RNA wurden die Zellen mit Lysing Matrix B und einem FastPrep-Instrument (beide MP Biomedicals) lysiert und die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) isoliert. RNAs wurden mit TURBO DNase (Ambion) behandelt, unter Verwendung des RNA Cleanup-Protokolls aus dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) gereinigt und bei –80 °C gelagert. Die Integrität der RNA wurde abschließend mit einem Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies) analysiert.

rRNA-Depletion, Bibliotheksaufbau und Sequenzierung. Entfernung von 23 S-, 16 S- und 5 S-rRNA mit dem RiboZero rRNA Removal Kit (Epicenter) (zweimal), strangspezifische Bibliothekskonstruktion, die Fragmente im Größenbereich von 100–500 bp ergibt, Pooling der 12 indizierten Bibliotheken, Sequenzierung in Eine Durchflusszellenspur auf einem Illumina HiSeq2000-Instrument mit einem 75-nt-Paired-End-Protokoll und das Demultiplexen der 12 Proben indizierter Lesevorgänge wurde von der „Next Generation Sequencing (NGS) Core Facility“ des Instituts für Integrative Biologie der USA durchgeführt Zelle (I2BC, Gif sur Yvette, Frankreich).

Lesen Sie die Kartierung und Analyse des Differentialausdrucks. Der differenzielle Ausdruck aller annotierten Merkmale wurde mithilfe der statistischen Programmierumgebung R bewertet. Die unterschiedliche Expression wurde zwischen den Wildtyp-Stammproben (St29, n = 3) und jeder der 9 Proben (jeweils n = 3) bestimmt, in denen sigH, comK1 oder comK2 fehlten. Das Ergebnis der Differenzialausdrucksanalyse ist in den Ergänzungstabellen 2–5 dargestellt. Gene mit durch die falsche Entdeckungsrate (FDR) korrigierten P-Werten < 0,01 und einem Verhältnis der differentiellen Expression über 2, 3 oder 5 wurden als signifikant differentiell exprimiert angesehen und werden dargestellt.

Datenzugänglichkeit. Der gesamte Satz an RNA-seq-Daten ist unter der GEO-Einreichung GSE224932 zusammengestellt und zugänglich.

Exoprotein-Isolierung. S. aureus-Kulturen (Wildtyp, St12; ΔsigH, St45 und ΔcomK2, St 38) wurden 19,5 Stunden lang in 10 ml CS2 in 50 ml Falcon-Röhrchen gezüchtet. Kulturüberstände wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 6000 U/min (4 °C) gesammelt, um Bakterien zu entfernen, gefolgt von einer Filtration durch einen 0,22-µm-Filter, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Proteine ​​in den Kulturüberständen wurden über Nacht bei 4 °C in 20 % (v/v) Trichloressigsäure (TCA) ausgefällt. Die ausgefällten Proteine ​​wurden durch 45-minütige Zentrifugation bei 13.000 U/min (4 °C) sedimentiert und die Pellets mit 96 % Ethanol gewaschen. Die Proteinpellets wurden schließlich 30 Minuten lang bei 13.000 U/min (4 °C) zentrifugiert, das restliche Ethanol entfernt und die Pellets an der Luft trocknen gelassen.

Exoprotein-Profilierung. Ausgefällte Exoproteine ​​wurden in 18 µl 1× PBS resuspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Zugabe von 20 µl 2× Tris-Glycin-SDS-Novex-Puffer (ThermoFisher) und 1 M DTT wurden die Proben 10 Minuten bei 95 °C inkubiert. Exoproteine ​​wurden schließlich in einem 4–12 % Tris-Glycin-Gel (Invitrogen) aufgetrennt und mittels Coomassie-Färbung sichtbar gemacht.

Exoprotein-Probenvorbereitung und LC-MS-Analyse. Die die gesamte Probe enthaltenden Banden wurden geschnitten und einem Trypsinverdau im Gel unter Verwendung von Standardbedingungen einschließlich Reduktion und Alkylierung unterzogen. Durch Trypsin erzeugte Peptide wurden durch nanoLC-MSMS unter Verwendung eines nanoElute-Flüssigkeitschromatographiesystems (Bruker) analysiert, das an ein timsTOF Pro-Massenspektrometer (Bruker) gekoppelt war. Die Peptide wurden auf eine Aurora-Analysesäule (ION OPTIK, 25 cm × 75 m, C18, 1,6 m) geladen und mit einem Gradienten von 0–35 % des Lösungsmittels B 100 Minuten lang getrennt. Lösungsmittel A war 0,1 % Ameisensäure und 2 % Acetonitril in Wasser und Lösungsmittel B war Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure. MS- und MS/MS-Spektren wurden von m/z 100 bis 1700 mit einem Mobilitätsscanbereich von 0,6 bis 1,4 V s/cm2 aufgezeichnet. MS/MS-Spektren wurden mit dem auf Ionenmobilität basierenden PASEF-Erfassungsmodus (Parallel Accumulation Serial Fragmentation) unter Verwendung einer auf 10 eingestellten Anzahl von PASEF-MS/MS-Scans erfasst.

Datenanalyse. MS- und MSMS-Rohdaten wurden mit der DataAnalysis-Software (Bruker) verarbeitet und in mgf-Dateien konvertiert. Proteinidentifizierungen wurden mithilfe der MASCOT-Suchmaschine (Matrix Science, London, UK) anhand der S. aureus-Datenbank durchgeführt. Datenbanksuchen wurden unter Verwendung der Trypsin-Spaltungsspezifität mit zwei möglichen fehlenden Spaltungen durchgeführt. Die Carbamidomethylierung von Cysteinen wurde als feste Modifikation und die Oxidation von Methioninen als variable Modifikation festgelegt. Die Peptid- und Fragmenttoleranzen wurden auf 10 ppm bzw. 0,05 Da festgelegt. Proteine ​​wurden validiert, wenn sie mit mindestens zwei einzigartigen Peptiden identifiziert wurden. Berücksichtigt wurden nur Ionen mit einem Wert über dem Identitätsschwellenwert und einer Falsch-Positiv-Entdeckungsrate von weniger als 1 % (Option „Maskottchen-Köder“). Die auf Massenspektrometrie basierende Quantifizierung wurde durch markierungsfreie Quantifizierung unter Verwendung der Spektralzählmethode durchgeführt. Die Gesamtwerte der MS/MS-Spektralzählung wurden aus der Scaffold-Software (Version Scaffold 4.11.1, Proteome Software Inc, Portland, OR) extrahiert und mit 95 % Wahrscheinlichkeit und 0,1 % FDR für Protein- bzw. Peptidschwellenwerte gefiltert. Für die statistische Analyse wurden fehlende Werte, die in Spektralzähldatensätzen auf Proteinebene auftraten, durch einen konstanten Wert von 0,1 unterstellt. Um die Variation innerhalb der Probe in Datensätzen zur Spektralzählung zu berücksichtigen, wurde ein Beta-Binomialtest basierend auf dreifachen MS/MS-Analysen mit P-Werten durchgeführt, die mit dem R-Paket „ibb“ (Version 13.06, 61) berechnet wurden. Proteine ​​wurden mit einem P-Wert < 0,05 und einer fachen Änderung von mehr als zwei gefiltert.

Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatz-ID PXD040550 und 10.6019/PXD040550 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

Die Sauerstoffkonzentrationen wurden mit den Sauerstoffsensorspots SP-PSt3-SA23-D3-OIW (PreSens GmbH, Regensburg, Deutschland) gemessen. Diese Sensorspots wurden mit Silikonkleber an der Innenwand von 50-ml-Falcon-Röhrchen befestigt, sodass die Spots während der Experimente immer eingetaucht waren (dh unterhalb der 5-ml-Marke). Die Falcon-Röhren wurden bei T0 geschlossen und blieben während des gesamten Experiments geschlossen.

Die Sensorpunkte sind mit einer sauerstoffempfindlichen Beschichtung bedeckt, bei der molekularer Sauerstoff die Lumineszenz eines inerten Metallporphyrinkomplexes löscht, der in einer sauerstoffdurchlässigen Matrix immobilisiert ist. Dieses Verfahren garantiert eine hohe zeitliche Auflösung und eine Messung ohne Drift oder Sauerstoffverbrauch.

Die Photolumineszenzlebensdauer des Luminophors im Sensorfleck wurde mithilfe einer optischen Polymerfaser gemessen, die mit einem Sauerstoffmessgerät (Fibox 4 Trace; PreSens GmbH) verbunden war. Das Anregungslicht (505 nm) wurde über eine Glasfaser zugeführt, die auch das emittierte Fluoreszenzsignal (600 nm) zurück zum Sauerstoffmessgerät transportierte. Kurz gesagt wurde eine Sauerstoffmessung durch den Kunststoff des Falcon-Rohrs durchgeführt, indem man sich einfach der optischen Faser vom Sensorpunkt aus näherte. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Sauerstoffkonzentration dreimal gemessen und die bereitgestellten Ergebnisse stellen den Mittelwert dieser drei Messungen dar. In unseren Experimenten wurde die Sauerstoffkonzentration alle 30 Minuten gemessen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Der gesamte Satz an RNA-seq-Daten ist unter der GEO-Einreichung GSE224932 zusammengestellt und zugänglich. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatz-ID PXD040550 und 10.6019/PXD040550 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Alle weiteren Daten sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten sind als Ergänzungsdatentabelle verfügbar.

Gordon, RJ & Lowy, FD Pathogenese einer Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Infektion. Klin. Infizieren. Dis. 46, S350–S359 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Klevens, RM Invasive Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Infektionen in den Vereinigten Staaten. Marmelade. Med. Assoc. 298, 1763 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Dietz, I., Jerchel, S., Szaszák, M., Shima, K. & Rupp, J. Wenn der Sauerstoff knapp wird: Die Mikroumgebung treibt Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen voran. Mikroben infizieren. 14, 311–316 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Beenken, KE et al. Globale Genexpression in Staphylococcus aureus-Biofilmen. J. Bakteriol. 186, 4665–4684 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hiramatsu, K. et al. Multiresistenter Staphylococcus aureus und zukünftige Chemotherapie. J. Infizieren. Chemother. 20, 593–601 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zentren für Krankheitskontrolle und Prävention. (CDC). Größte Bedrohungen. Verfügbar unter http://www.cdc.gov/drugresistance. (2013).

Lindsay, JA Genomische Variation und Evolution von Staphylococcus aureus. Int. J. Med. Mikrobiol. 300, 98–103 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Morikawa, K. et al. Die Expression eines kryptischen sekundären Sigma-Faktor-Gens enthüllt die natürliche Fähigkeit zur DNA-Transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solomon, JM & Grossman, AD Wer ist kompetent und wann: Regulierung der natürlichen genetischen Kompetenz bei Bakterien. Trends Genet. 12, 150–155 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Sinderen, D. et al. comK kodiert den Kompetenztranskriptionsfaktor, das wichtigste regulatorische Protein für die Kompetenzentwicklung in Bacillus subtilis. Mol. Mikrobiol. 15, 455–462 (1995).

Artikel PubMed Google Scholar

Meibom, KL, Blokesch, M., Dolganov, NA, Wu, CY & Schoolnik, GK Chitin induziert natürliche Kompetenz bei Vibrio cholerae. Wissenschaft 310, 1824–1827 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, MS & Morrison, DA Identifizierung eines neuen Regulators bei Streptococcus pneumoniae, der Quorum Sensing mit der Kompetenz für genetische Transformation verknüpft. J. Bakteriol. 181, 5004–5016 (1999).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morikawa, K. et al. Ein neuer Staphylokokken-Sigma-Faktor in der konservierten Genkassette: funktionelle Bedeutung und Implikation für die Evolutionsprozesse. Genes Cells 8, 699–712 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fagerlund, A., Granum, PE & Havarstein, LS Staphylococcus aureus-Kompetenzgene: Kartierung der SigH-, ComK1- und ComK2-Regulons durch Transkriptomsequenzierung. Mol. Mikrobiol. 94, 557–579 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chung, YS, Breidt, F. & Dubnau, D. Lokalisierung und Verarbeitung der ComG-Proteine ​​auf der Zelloberfläche, die für die DNA-Bindung während der Transformation von Bacillus subtilis erforderlich sind. Mol. Mikrobiol. 29, 905–913 (1998).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Solomon, JM, Magnuson, R., Srivastava, A. & Grossman, AD Konvergente Wahrnehmungswege vermitteln die Reaktion auf zwei extrazelluläre Kompetenzfaktoren in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9, 547–558 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Moreno-Gámez, S. et al. Quorum Sensing integriert Umweltreize, Zelldichte und Zellgeschichte, um die bakterielle Kompetenz zu steuern. Nat. Komm. 8, 854 (2017).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Lo Scrudato, M. & Blokesch, M. Das regulatorische Netzwerk der natürlichen Kompetenz und Transformation von Vibrio cholerae. PLoS Genet. 8, e1002778 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Le, KY & Otto, M. Quorum-Sensing-Regulation bei Staphylokokken – ein Überblick. Vorderseite. Mikrobiol. 6, 1174 (2015).

Maree, M. et al. Die natürliche Transformation ermöglicht die Übertragung der SCCmec-vermittelten Methicillinresistenz in Staphylococcus aureus-Biofilmen. Nat. Komm. 13, 2477 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Berka, RM et al. Microarray-Analyse des K-Zustands von Bacillus subtilis: genomweite Expressionsänderungen abhängig von ComK. Mol. Mikrobiol. 43, 1331–1345 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ogura, M. et al. Gesamtgenomanalyse von Genen, die durch den Bacillus subtilis-Kompetenztranskriptionsfaktor ComK reguliert werden. J. Bakteriol. 184, 2344–2351 (2002).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dagkessamanskaia, A. et al. Zusammenhang von Kompetenz, Stress und CiaR-Regulonen bei Streptococcus pneumoniae: Kompetenz löst die Autolyse stationärer ciaR-mutierter Zellen aus. Mol. Mikrobiol. 51, 1071–1086 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Peterson, SN et al. Identifizierung von auf Kompetenzpheromonen reagierenden Genen in Streptococcus pneumoniae mithilfe von DNA-Mikroarrays. Mol. Mikrobiol. 51, 1051–1070 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kato, F., Yoshizumi, S., Yamaguchi, Y. & Inouye, M. Genomweites Screening zur Identifizierung neuer Toxin-Antitoxin-Systeme in Staphylococcus aureus. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 85, e00915–e00919 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, Q., Yeo, W. & Bae, T. Das SaeRS-Zweikomponentensystem von Staphylococcus aureus. Gene 7, 81 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yarwood, JM, McCormick, JK & Schlievert, PM Identifizierung eines neuartigen Zweikomponenten-Regulationssystems, das an der globalen Regulierung der Virulenzfaktoren von Staphylococcus aureus beteiligt ist. J. Bakteriol. 183, 1113–1123 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schlag, S. et al. Charakterisierung des auf Sauerstoff reagierenden NreABC-Regulons von Staphylococcus aureus. J. Bakteriol. 190, 7847–7858 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, F. et al. AirSR, ein [2Fe-2S]-Cluster enthaltendes Zweikomponentensystem, vermittelt die globale Sauerstofferkennung und Redoxsignalisierung in Staphylococcus aureus. Marmelade. Chem. Soc. 134, 305–314 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Claverys, J.-PP, Prudhomme, M. & Martin, B. Induktion von Kompetenzregulonen als allgemeine Reaktion auf Stress bei grampositiven Bakterien. Annu. Rev. Microbiol. 60, 451–475 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lichev, A., Angelov, A., Cucurull, I. & Liebl, W. Aminosäuren als Ernährungsfaktoren und (p)ppGpp als Alarmon der stringenten Reaktion regulieren die natürliche Transformation in Micrococcus luteus. Wissenschaft. Rep. 9, 11030 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Macfadyen, LP et al. Die Kompetenzentwicklung von Haemophilus influenzae wird durch die Verfügbarkeit von Nukleinsäurevorläufern reguliert. Mol. Mikrobiol. 40, 700–707 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Findlay Black, H. et al. Ein kompetenzreguliertes Toxin-Antitoxin-System bei Haemophilus influenzae. PLoS ONE 15, e0217255 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chan, WT & Espinosa, M. Das pezAT-Toxin-Antitoxin-System von Streptococcus pneumoniae reduziert die β-Lactam-Resistenz und die genetische Kompetenz. Vorderseite. Mikrobiol. 7, 1322 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jaskólska, M., Stutzmann, S., Stoudmann, C. & Blokesch, M. QstR-abhängige Regulierung der natürlichen Kompetenz und Typ-VI-Sekretion bei Vibrio cholerae. Nukleinsäuren Res. https://doi.org/10.1093/nar/gky717 (2018).

Cafini, F. et al. Methodik zur Untersuchung des horizontalen Gentransfers bei Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/55087-v (2017).

Cordero, M. et al. Die Induktion der natürlichen Kompetenz passt den Staphylokokkenstoffwechsel an die Infektion an. Nat. Komm. 13, 1525 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balasubramanian, D., Harper, L., Shopsin, B. & Torres, VJ Staphylococcus aureus Pathogenese in verschiedenen Wirtsumgebungen. Pathog. Dis. https://doi.org/10.1093/femspd/ftx005 (2017).

Wilde, AD et al. Bakterielle hypoxische Reaktionen wurden durch die TnSeq-Analyse einer invasiven Infektion mit Staphylococcus aureus als entscheidende Determinanten für das Wirt-Pathogen-Ergebnis identifiziert. Plus Pathog. 11, e1005341 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Vitko, NP, Spahich, NA & Richardson, AR Glykolytische Abhängigkeit von hoher Stickoxidresistenz und Virulenz bei Staphylococcus aureus. MBio 6, e00045–15 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Kreiswirth, BN et al. Das Strukturgen des Exotoxins für das toxische Schocksyndrom wird von einem Prophagen nicht nachweisbar übertragen. Nature 305, 709–712 (1983).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fey, PD et al. Eine genetische Ressource für ein schnelles und umfassendes Phänotyp-Screening nichtessentieller Gene von Staphylococcus aureus. mBio. 4, e00537-12 (2013).

Pourcel, C. et al. Verbesserter Multi-Locus-Tandem-Repeat-Assay mit variabler Anzahl für die Genotypisierung von Staphylococcus aureus, der eine äußerst informative Technik zusammen mit einem hohen phylogenetischen Wert bietet. J. Clin. Mikrobiol. 47, 3121–3128 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Monk, IR, Shah, IM, Xu, M., Tan, M.-W. & Foster, TJ Transformieren des Untransformierbaren: Anwendung der direkten Transformation zur genetischen Manipulation von Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis. MBio 3, e00277–11 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Charpentier, E. et al. Neuartiges kassettenbasiertes Shuttle-Vektorsystem für grampositive Bakterien. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 70, 6076–6085 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Wir danken Kazuya Morikawa und Tarek Msadek für die Bereitstellung von S. aureus-Stämmen und -Konstrukten sowie für die wissenschaftlichen Diskussionen. Wir möchten uns auch bei den Imagerie-Gif-Einrichtungen für Durchflusszytometrie und Proteomik (SICaPS) (Institut für integrative Biologie der Zelle, I2BC, Gif sur Yvette, FRANKREICH) für ihre Hilfe und Unterstützung bedanken. Wir würdigen auch die Sequenzierungs- und Bioinformatik-Expertise der I2BC-Hochdurchsatz-Sequenzierungsanlage, die von France Génomique unterstützt wird (finanziert durch das französische Nationalprogramm „Investissement d'Avenir“ ANR-10-INBS-09).

Diese Arbeit wurde durch ein „Young Researcher Grant“ der französischen Nationalen Forschungsagentur an Nicolas Mirouze (ANR-18-CE35-0004 GenTranSa) und ein PhD-Stipendium des Chinese Scholarship Council (CSC) an Shi Yuan Feng unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Shi Yuan Feng, Yolande Hauck.

Universität Paris-Saclay, CEA, CNRS, Institut für Integrative Biologie der Zelle (I2BC), 91198, Gif-Sur-Yvette, Frankreich

Shi Yuan Feng, Yolande Hauck, Fedy Morgene, Rosa Mohammedi und Nicholas Mirouze

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SYF: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung; YH: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung; FM: Konzeptualisierung, Methodik, Untersuchung; RM: Methodik, Untersuchung; NM: Konzeptualisierung, Betreuung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Projektverwaltung und Finanzierungseinwerbung

Korrespondenz mit Nicolas Mirouze.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: George Inglis und Tobias Goris. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Feng, SY, Hauck, Y., Morgene, F. et al. Die komplexe Kompetenzregulation bei Staphylococcus aureus unter mikroaeroben Bedingungen. Commun Biol 6, 512 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

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Eingegangen: 19. Juli 2022

Angenommen: 28. April 2023

Veröffentlicht: 12. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04892-1

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