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Nov 10, 2023

Nitritakkumulation und Anammox-Bakterien-Nischenaufteilung in Arctic Mid

ISME Communications Band 3,

ISME Communications Band 3, Artikelnummer: 26 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Durch den Verzehr von Ammonium und Nitrit bilden Anammox-Bakterien eine wichtige funktionelle Gruppe im Stickstoffkreislauf in vielen Umgebungen, einschließlich Meeressedimenten. Ihre Verteilung und Wirkung auf das wichtige Substrat Nitrit ist jedoch nicht gut charakterisiert. Hier kombinierten wir biogeochemische, mikrobiologische und genomische Ansätze, um Anammox-Bakterien und andere Stickstoffkreislaufgruppen in zwei Sedimentkernen zu untersuchen, die aus dem Arktischen Mittelozeanischen Rücken (AMOR) entnommen wurden. Wir beobachteten die Anreicherung von Nitrit in diesen Kernen, ein Phänomen, das auch an 28 anderen Meeressedimentstandorten und in analogen Gewässern beobachtet wurde. Das Nitritmaximum geht mit einer verringerten Häufigkeit von Anammox-Bakterien einher. Die Häufigkeit von Anammox-Bakterien war mindestens eine Größenordnung höher als die von Nitritreduzierern, und die Häufigkeitsmaxima von Anammox wurden in den Schichten oberhalb und unterhalb des Nitritmaximums festgestellt. Die Anreicherung von Nitrit in den beiden AMOR-Kernen geht mit einer Nischenaufteilung zwischen zwei Anammox-Bakterienfamilien (Candidatus Bathyanammoxibiaceae und Candidatus Scalinduaceae) einher, die wahrscheinlich von der Verfügbarkeit von Ammonium abhängt. Durch die Rekonstruktion und den Vergleich der dominanten Anammox-Genome (Ca. Bathyanammoxibius amoris und Ca. Scalindua sediminis) haben wir herausgefunden, dass Ca. B. amoris hat weniger hochaffine Ammoniumtransporter als Ca. S. sediminis und verfügt nicht über die Fähigkeit, auf alternative Substrate und/oder Energiequellen wie Harnstoff und Cyanat zuzugreifen. Diese Funktionen können Ca einschränken. Bathyanammoxibiaceae auf Bedingungen mit höheren Ammoniumkonzentrationen. Diese Ergebnisse verbessern unser Verständnis des Stickstoffkreislaufs in Meeressedimenten, indem sie die gleichzeitige Anreicherung von Nitrit und die Nischenaufteilung von Anammox-Bakterien aufdecken.

Der Stickstoffkreislauf in Ökosystemen wird durch ein Netzwerk von Prozessen gesteuert, die durch Mikroorganismen vermittelt werden. In einem Ökosystem wird neuer bioverfügbarer (oder fixierter) Stickstoff durch Diazotrophie erzeugt und kann durch zwei Stickstoffverlustprozesse wieder in N2 umgewandelt werden: Denitrifikation und anaerobe Ammoniumoxidation (Anammox) [siehe die Übersicht in z. B. [1]]. Die beiden letztgenannten anaeroben Stoffwechselvorgänge werden im Allgemeinen in Umgebungen mit niedrigem Sauerstoffgehalt bevorzugt, entweder in den pelagischen Sauerstoffminimumzonen des Ozeans oder in benthischen Sedimenten [2]. Frühere Schätzungen deuten darauf hin, dass der fixierte Stickstoffverlust im Benthos weltweit 1,3- bis 3-mal größer ist als in der Wassersäule [3,4,5]. Daher spielen sedimentäre Stickstoffverlustprozesse eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Menge an bioverfügbarem Stickstoff in Meereslebensräumen. Nitrit ist ein entscheidendes Substrat sowohl für Anammox als auch für Denitrifikation [6, 7], dessen Verfügbarkeit eine tiefgreifende Kontrolle über das Ausmaß des Stickstoffverlusts ausübt [8]. Allerdings reichert sich Nitrit in marinen Sedimenten selten in so hohen Mengen an wie Nitrat und Ammonium, was dazu führt, dass das Vorkommen und die Umwandlungswege von Nitrit in dieser riesigen Umgebung weitgehend übersehen werden. Anammox-Bakterien gehören zu den Hauptkonsumenten von Nitrit, da sie diese Verbindung unbedingt zur Oxidation von Ammonium benötigen.

Seit seiner Entdeckung in der Meeresumwelt vor zwei Jahrzehnten [8] hat sich gezeigt, dass Anammox einen erheblichen Beitrag zum Verlust fester Stickstoffe leistet [z. B. [9]. Unter den zuvor bekannten marinen Anammox-Bakterien (zugehörig zu den Familien Candidatus Brocadiaceae und Candidatus Scalinduaceae) sind Mitglieder von Ca. Scalinduaceae wurden regelmäßig in Meeressedimenten nachgewiesen [10,11,12,13] und mehrere Anreicherungskulturen wurden aus Küstensedimenten gewonnen [z. B. Ca. Scalindua japonica [14] und Ca. Scalindua profunda [15]]. Obwohl es scheinbar allgegenwärtig ist, ist Ca. Scalinduaceae sind möglicherweise nicht die einzige Anammox-Bakterienfamilie, die in Meeressedimenten vorkommt. Kürzlich wurde durch die Untersuchung metagenomassemblierter Genome aus Sedimenten des Arktischen Mittelozeanischen Rückens (AMOR) und aus der Grundwasserumgebung eine neue Familie von Anammox-Bakterien entdeckt (dh Candidatus Bathyanammoxibiaceae [16]). In den AMOR-Kernen sind sowohl Ca. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae sind auf die Nitrat-Ammonium-Übergangszone und Ca beschränkt. Bathyanammoxibiaceae können ihre Artgenossen von Ca manchmal zahlenmäßig deutlich übertreffen. Scalinduaceae [16]. Die Koexistenz zweier funktionell (fast) identischer Abstammungslinien in AMOR-Sedimenten warf die Frage auf, ob diese Familien dieselbe Nische besetzen und welchen Einfluss sie auf die Verteilung und Umwandlung von Nitrit haben könnten.

Angesichts ihrer Verbreitung in Tiefseesedimenten wurde vermutet, dass Anammox-Bakterien eine wichtige Rolle beim Verbrauch des nach oben diffusiven Flusses von Ammonium spielen und den Transport von Ammonium aus Sedimenten in das darüber liegende Meerwasser verhindern [13]. Da Nitrit ein notwendiges Substrat für Anammox ist [6], nehmen wir an, dass analog dazu die Häufigkeit und Stoffwechselaktivität von Anammox neben Ammonium auch einen starken Einfluss auf die Verteilung von Nitrit haben könnte. Um diese Hypothese zu testen, kombinierten wir biogeochemische, mikrobiologische und genomische Ansätze, um die Beziehungen zwischen der Verteilung gelöster Stickstoffspezies und Anammox-Bakterien und anderen Stickstoffkreislaufgruppen zu untersuchen. Wir haben zunächst ein Phänomen der Nitritakkumulation in der Nitratverarmungszone in verschiedenen marinen Sedimentsystemen identifiziert: dem Kontinentalhang, mittelozeanischen Rücken und auch Hadalgräben. Durch hochauflösende Analysen mikrobieller Gemeinschaften in zwei AMOR-Sedimentkernen mit offensichtlicher Nitritakkumulation beobachteten wir eine Nischenaufteilung von Anammox-Bakterien zwischen den Familien Ca. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae, die in Meeressedimenten weit verbreitet sind. Basierend auf den neu generierten hochwertigen Anammox-Genomen haben wir auch die wahrscheinlich zugrunde liegenden genetischen Mechanismen vorgeschlagen, die die beobachtete Nischenaufteilung vorantreiben.

Die Messung von Nitrit im Sedimentporenwasser, zusammen mit Ammonium und Nitrat, wurde für über ein Dutzend Sedimentkerne versucht, die während unserer Kreuzfahrten in das Gebiet des Arktischen Mittelozeanischen Rückens (AMOR) vom Meeresboden entnommen wurden (z. B. [13, 17]). . Allerdings wurden kohärente Nitritprofile (definiert als >2 aufeinanderfolgende Tiefen mit nachweisbaren Nitritkonzentrationen) nur in zwei Kernen festgestellt: GS14-GC04 und GS16-GC04 (siehe Ergebnisse unten). Diese beiden Kerne boten die Gelegenheit, die zugrunde liegenden Mechanismen der Nitritakkumulation zu untersuchen, ein einzigartiges geochemisches Phänomen, das in Meerwasser von Sauerstoffmangelzonen [z. B. [18]], jedoch nicht in Meeressedimenten gut untersucht wurde. Da der allgemeine geochemische Kontext [13], mikrobiologische Daten [13] und Anammox-Bakteriengemeinschaften [16] des Kerns GS16-GC04 bereits veröffentlicht wurden, liefern wir im Folgenden ausführliche Beschreibungen für den Kern GS14-GC04.

GS14-GC04 ist ein 2,4 m langer Kern, der von einem 1050 m tiefen Meeresberg 50 km westlich der hydrothermalen Quellenfelder Jan Mayen (Abb. 1A) auf dem arktischen Mittelozeanischen Rücken geborgen wurde, wo über hydrothermale Quellen mit weißem Rauch berichtet wurde [19]. , 20]. Der Gesamtgehalt an organischem Stickstoff (Abb. S1A) in den geborgenen Sedimenten von GS14-GC04 wurde mit einem Wert im Bereich von 0,06–0,11 % gemessen, während der Gesamtgehalt an organischem Kohlenstoff mit weniger als 0,5 Gew.-% gemessen wurde (Abb. S2A). . Daher lag das berechnete Kohlenstoff-Stickstoff-Verhältnis (C/N) im Allgemeinen im Bereich von 2–4 (Abb. S1B). An der Oberseite des geborgenen Bohrkerns wurde gemessen, dass der Sauerstoffgehalt nur 15 µM betrug und er innerhalb von 23 cm unter dem Meeresboden erschöpft war. Unterhalb der Sauerstoffverarmungstiefe sammelte sich gelöstes Mn im Porenwasser an (Abb. S2B), ein Phänomen, das auch in anderen Sedimentkernen aus der AMOR-Region auftritt [13]. Der pH-Wert des Porenwassers fiel zwischen 7,6 und 7,8 (Abb. S1C), ähnlich wie in anderen AMOR-Kernen [13]. Im gesamten Kern wurde kein gelöstes Fe nachgewiesen (Abb. S1D), was darauf hindeutet, dass die Reduktion von Fe in den gewonnenen Sedimenten keine Rolle spielt. GS14-GC04 wies höhere Konzentrationen an gelöstem anorganischem Kohlenstoff (DIC) auf (Abb. S2) als GS16-GC04 und die anderen AMOR-Kerne ohne nennenswerte hydrothermale Einflüsse [13], was auf eine höhere Aktivität beim Abbau organischer Stoffe in GS14-GC04 hinweist. Obwohl die obersten Sedimente von GS14-GC04 während der Kernbohrung möglicherweise verloren gingen (siehe Ergänzende Anmerkung 1), war die Sauerstoffeindringtiefe dieses Kerns geringer als die der nicht-hydrothermischen Standorte (z. B. ~110 cm in GS16-GC04 (Abb. 1C und). S2D) und 35–100 cm in den anderen drei zuvor in [13] beschriebenen Kernen und hat keinen Einfluss auf unsere Interpretation tieferer anaerober Mikroben und ihres Stoffwechsels.

Einebathymetrische Karte, die zwei Bohrstellen (GS14-GC04, untersucht in dieser Studie und GS16-GC04, untersucht in Lit. [13]) im Gebiet des arktischen Mittelozeanischen Rückens zeigt, wo eine Nitritansammlung beobachtet wurde. Ebenfalls hervorgehoben sind die Jan-Mayen-Bruchzone und der Mohns-Rücken sowie das hydrothermale Schlotfeld Jan Mayen (gelber Stern). Anreicherung von Nitrit in den beiden AMOR-Sedimentkernen. Gezeigt werden Porenwasserprofile von Nitrat, Nitrit und Ammonium von (B) GS14-GC04 und (C) GS16-GC04. Die oxischen Zonen und zwei (obere und untere) Nettonitritverbrauchszonen werden durch horizontale Bänder hervorgehoben. D Sedimentstellen, an denen eine Nitritanreicherung im Sedimentporenwasser festgestellt wurde. Die beiden AMOR-Standorte sind in roten Kreisen dargestellt, während andere Standorte in gelben Kreisen dargestellt sind (siehe Abb. S3 für die Porenwassernitrit- und Nitratprofile einzelner Standorte). Die Karten in (A) und (D) wurden mit GeoMapApp v. 3.6.14 (www.geomapapp.org) unter Verwendung der standardmäßigen Global Multi-Resolution Topography Synthesis-Grundkarte erstellt. (E) Nitratzufluss und (kombiniert nach oben und unten) Nitritausfluss in den Nitratverarmungszonen der 30 in (D) gezeigten Sedimentstandorte. Die gepaarten Flüsse für jeden Standort sind durch eine schwarze gepunktete Linie verbunden. F Berechnetes Nitrit-/Nitrat-Flussverhältnis für die einzelnen Standorte. Die horizontale Linie stellt den Mittelwert der 30 Standorte dar, während die gestrichelten Linien das 95 %-Konfidenzintervall darstellen.

Im Gegensatz zu GS16-GC04 (Abb. 1C) und den anderen zuvor in [13] beschriebenen AMOR-Kernen, bei denen die Gegengradienten von Nitrat und Ammonium innerhalb der dünnen Nitrat-Ammonium-Übergangszone zusammenlaufen, weist Kern GS14-GC04 eine vertikale Trennung zwischen den Kernen auf Abwärtsfluss von Nitrat und Aufwärtsfluss von Ammonium. Das Nitrat in GS14-GC04 nahm mit der Tiefe ab und war bei etwa 130 cm erschöpft (Abb. 1B). Allerdings wurde Ammonium in diesem Kern erst in 213 cm Tiefe im Porenwasser nachgewiesen, deutlich unterhalb der Nitratabbautiefe (Abb. 1B).

Im Gegensatz zu den meisten AMOR-Sedimentkernen, bei denen Nitrit routinemäßig gemessen wurde, aber im Allgemeinen in allen gemessenen Tiefen nicht nachweisbar war [17], sammelte sich Nitrit in GS14-GC04 um die Nitratverarmungszone (50–180 cm) herum an, mit einem Konzentrationsmaximum (~3 µM) bei 105 cm (Abb. 1B). Eine ähnliche Nitritanreicherung, wenn auch von geringerer Stärke (~ 1 µM) und kürzerer vertikaler Spanne (150–200 cm), wurde auch in der Nitratverarmungszone von GS16-GC04 festgestellt (Abb. 1C). Bei der Durchsuchung der veröffentlichten Literatur haben wir herausgefunden, dass eine solche Anreicherung von Nitrit rund um die Nitratverarmungszone in 28 weiteren weltweit verteilten Sedimentkernen zu beobachten ist (Abb. 1D; siehe die detaillierten Nitrit-, Nitrat- und Ammoniumprofile in einzelnen Kernen in der ergänzenden Abb. S3). Eine solche Ansammlung wurde hauptsächlich in Sedimenten an den Kontinentalhängen [z. B. [21,22,23,24]], entlang der mittelozeanischen Rücken [25] des Pazifiks und Atlantischen Ozeans sowie in Hadalgräben im Pazifik [10] festgestellt , 26, 27], und nicht entlang des Kontinentalrandes oder in den Tiefseeebenen (Abb. 1D). Die meisten dieser Standorte sammeln Nitrit innerhalb der Nitrat-Ammonium-Übergangszone an (Abb. S3), wo die Anammox-Reaktion stattfindet [13]. Diese Übereinstimmung deutet auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Anammox-Bakterien und der beobachteten Nitrit-Akkumulation hin. Eine Anreicherung von Nitrit wurde in den oberen paar Metern der Sedimente (i) an Kontinentalrändern kaum festgestellt, da die Nitratdurchdringung zu flach ist, um ohne spezielle Messungen im Mikromaßstab richtig aufgelöst werden zu können, und (ii) in Tiefseeebenen [z. B. [26]] aufgrund des hohen Porenwassergehalts Konzentrationen von Nitrat und O2 sind tief im Sediment vorhanden [26, 28,29,30]. Durch diesen Vergleich ist es wahrscheinlich, dass die beobachtete Nitritakkumulation in Sedimenten von Kontinentalhängen, mittelozeanischen Rücken und Hadalgräben eng mit niedrigen Nitratkonzentrationen innerhalb der Nitratverarmungszone zusammenhängt, die wiederum durch mäßige Nitratkonzentrationen verursacht werden Fluss organischer Substanz. Obwohl unsere Zusammenstellung darauf hindeutet, dass die Nitrit-Anreicherung weltweit an Sedimentstandorten mit mittlerem organischem Kohlenstoffregen verteilt ist, sind systematischere Probenahmen erforderlich, um die Häufigkeit und mechanistische Kontrolle der Nitrit-Anreicherung in marinen Sedimentsystemen zu bewerten.

Obwohl in Meeressedimenten nicht allgemein berichtet, wird eine mit sinkenden Nitratkonzentrationen einhergehende Nitritakkumulation häufig in anderen geschichteten Gewässern wie den Wassersäulen des Schwarzen Meeres [31, 32] und im Golfo Dulce [33], dem Süßwassersee Tanganjika [34], beobachtet. , hypersaline Seen Vanda und Bonney [35] in den McMurdo-Trockentälern in der Antarktis, Fluss- und Flussmündungssedimente [36, 37], subtropische Mangrovensedimente [38] und denitrifizierende Biofilme in Kläranlagen [39]. Die Beobachtungen deuten darauf hin, dass die Anreicherung von Nitrit in der nitratarmen Zone in verschiedenen aquatischen Umgebungen stattfindet, die Redoxgradienten aufweisen.

Die Maxima der Nitritkonzentration in den 30 Sedimentkernen (d. h. 2 AMOR-Standorte und 28 Referenzstandorte) liegen im Allgemeinen unter 3 µM (Abb. S3), wobei der maximale Nitritwert von 8 µM in Station 13 von [23] im Pazifischen Ozean festgestellt wurde (Standort Nr. 15 in Abb. 1D). Diese Nitritkonzentrationen sind vergleichbar oder höher als diejenigen, die in Sauerstoffmangelzonen gemessen werden [z. B. [40, 41]]. In den 30 Kernen sind die Nitritkonzentrationen im Allgemeinen niedriger als die begleitenden Nitratkonzentrationen, was darauf hindeutet, dass Nitrit nur eine untergeordnete anorganische Stickstoffspezies in den Sedimenten ist. Dennoch ist Nitrit ein zentraler Metabolit für viele Mikroorganismen, und die niedrigen Konzentrationen deuten nur darauf hin, dass sein schneller Umsatz gut mit der Umwelt gekoppelt ist, und dass es sich nicht um einen unwichtigen Metaboliten handelt [42].

In den beiden AMOR-Kernen waren die Nitrit-Akkumulationszonen gut von den darüber liegenden oxischen Zonen getrennt (Abb. 1B, C), was darauf hindeutet, dass aerobe Prozesse (z. B. Ammoniak- und Nitritoxidation) möglicherweise nicht wesentlich oder gar nicht zur Entstehung beitragen bzw. Verbrauch des angesammelten Nitrits. Stattdessen resultiert das angesammelte Nitrit eher aus dem Ungleichgewicht zwischen anaeroben Prozessen der Nitritproduktion (z. B. dissimilatorische Nitratreduktion) und dem Nitritverbrauch (z. B. Nitritreduktion und Anammox).

Die Ansammlung von Nitrit in der Nitratverarmungszone weist auch darauf hin, dass ein Teil des nachgewiesenen Nitrits sowohl nach oben als auch nach unten diffundieren kann und zwei unterschiedliche Zonen (z. B. oberhalb und unterhalb der Nitratverarmungstiefe) unterstützt, die einen verstärkten Nitritverbrauch beherbergen. Durch die Berechnung des Nitratzuflusses und des Gesamtausflusses (der Summe aus nach oben und unten gerichtetem) Nitritausfluss aus der Nitratverarmungszone der insgesamt 30 in Abb. 1D gezeigten Sedimentstandorte stellten wir fest, dass es bis auf einen Standort (Standort Nr. 14) an allen Standorten so war , Pacific Station 12, berichtet in [23]), ist der Nitratfluss an allen Standorten höher als der kombinierte Nitritfluss (Abb. 1E). Aus diesem Grund beträgt das berechnete Verhältnis von Nitrat- zu Nitritfluss an allen Standorten außer einem weniger als 0,6 (Abb. 1F), mit einem durchschnittlichen Verhältnis von 0,285 ± 0,07 (Mittelwert ± 95 % Konfidenzintervall). Diese Berechnung legt nahe, dass (i) der Nitritfluss nur etwa ein Viertel des in der Nitratverarmungszone verbrauchten Nitratflusses ausmacht und dass (ii) der Großteil des in diese Zone diffundierenden Nitrats durch weitere Reduzierung auf nicht gemessene Werte verloren geht gasförmige Verbindungen (z. B. N2).

Um herauszufinden, welche mikrobiellen Gruppen eine Rolle bei der Kontrolle der beobachteten Nitritakkumulation spielen, führten wir eine 16-S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung für 13 Sedimentschichten von GS14-GC04 durch, während ähnliche Daten von GS16-GC04 zuvor von [13] generiert wurden. Wir haben die Prävalenz mutmaßlicher Anammox-Bakterien (zugehörig zu beiden Familien Ca. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae [16]) in den meisten Schichten von GS14-GC04 festgestellt. Anammox-Bakterien, bekanntermaßen langsam wachsend [43], leisteten einen beträchtlichen Beitrag zu den Gemeinschaften in diesem Kern. Sie machten 6 % der Gesamtgemeinschaft in den obersten Sedimenten der oxischen Zone aus und erreichten einen ersten Höchstwert von 11 % der Gesamtgemeinschaft in der oberen Nitritverbrauchszone (Abb. 2A). Nach einem großen Zusammenbruch im Intervall von 75–120 cm nahm die relative Häufigkeit von Anammox wieder zu und erreichte den zweiten Höhepunkt von vollen ~18 % der Gesamtgemeinschaft innerhalb der zweiten Nitritverbrauchszone, bevor sie in tieferen Sedimenten wieder abnahm (Abb. 2A). Im Vergleich dazu machen Anammox-Gemeinschaften in anderen Systemen <5 % der Gesamtpopulation in Hadal-Sedimenten aus [10] und <2 % in der ODZ im Arabischen Meer [44]. Der zweite Peak lag ungefähr innerhalb der breiten Nitrat-Ammonium-Übergangszone. Im Gegensatz dazu wurden Anammox-Bakterien in GS16-GC04 hauptsächlich (bis zu 18 % der Gemeinschaft) innerhalb der Nitrat-Ammonium-Übergangszone (~120–190 cm) nachgewiesen, nicht jedoch in der oxischen Zone (Abb. 2J). Dennoch zeigt dieser zweite Kern wie GS14-GC04 zwei relative Häufigkeitsspitzen, die in den oberen und unteren Nettonitritverbrauchszonen beobachtet werden, die das Nitritmaximum flankieren (Abb. 2J).

Es werden Daten der beiden Kerne GS14-GC04 (A–I) und GS16-GC04 (J–R) angezeigt. Die Daten in (A–D) und (J–M) sind relative Häufigkeiten der funktionellen Gruppen, die durch 16 S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung ermittelt wurden. In (EI) und (NR) geben ausgefüllte Kreise die absoluten Häufigkeiten dieser Gruppen an, die durch qPCR unter Verwendung spezifischer Primer bestimmt wurden, die auf ihre diagnostischen Gene abzielen, während offene Kreise die absoluten Häufigkeiten von Anammox-Bakterien, AOA, AOB und NOB angeben, die als Produkt berechnet wurden der Gesamtzellzahl (dargestellt in Abb. S4A) und ihrer jeweiligen relativen Häufigkeit in der Gesamtgemeinschaft. Die Zonen werden gemäß den in Abb. 1B und C dargestellten Definitionen hervorgehoben, während die Nitritprofile auch in (A) und (J) neu dargestellt werden, um die beiden Netto-Nitritverbrauchszonen in jedem Kern zu kennzeichnen. Die Panels (J, N, R) des GS16-GC04-Kerns stammen aus den in Lit. veröffentlichten Daten. [16].

Um zu überprüfen, ob die relativen Häufigkeitsänderungen von Anammox-Bakterien durch Wachstum/Zerfall anderer Taxa im Vergleich zu denen von Anammox selbst verursacht werden, haben wir die absolute Häufigkeit von Anammox-Bakterien in den beiden AMOR-Kernen mithilfe zweier komplementärer Methoden verfolgt: (i) qPCR der funktionelles Gen hzo, das für Hydrazin-Dehydrogenase kodiert, den letzten Schritt des Anammox-Metabolismus und daher ein diagnostisches Gen für Anammox-Bakterien, und (ii) Berechnung als Produkt der gesamten Zellhäufigkeit (geschätzt als Summe der 16 S-rRNA-Gene). dargestellt in Abb. S4A für den Kern GS14-GC04) und die relativen Häufigkeiten, die sich aus der 16 S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung ergeben. Wie für andere AMOR-Kerne gezeigt [13], stimmen die Ergebnisse der beiden Methoden in den beiden Kernen im Allgemeinen überein (Abb. 2E, N), was darauf hinweist, dass die wichtigsten Anammox-Kladen in dieser Analyse berücksichtigt werden. Die Prävalenz von Anammox-Bakterien im oberen und unteren Teil von GS14-GC04 wurde durch ihre hohe absolute Häufigkeit im Bereich von 106–108 Zellen g−1 feuchtem Sediment bestätigt, während relativ geringere Häufigkeiten von 102–104 Zellen g−1 festgestellt wurden im mittleren Abschnitt des Kerns (75–120 cm bsf) (Abb. 3E). Im Gegensatz dazu waren Anammox-Bakterien in GS16-GC04 auf die Nitrat-Ammonium-Übergangszone beschränkt (Abb. 2N), ähnlich wie bei den anderen drei in [13] beschriebenen AMOR-Kernen. Daher legen unsere Ergebnisse von GS14-GC04 nahe, dass Anammox-Bakterien in Meeressedimenten weiter von der Nitrat-Ammonium-Zone entfernt gedeihen können als bisher angenommen.

AA-Heatmap, die das Vorkommen und die relative Häufigkeit von acht Anammox-OTUs in den untersuchten Sedimentschichten zeigt. Die taxonomische Klassifizierung der einzelnen OTUs, die unten in der Heatmap angezeigt wird, basiert auf den phylogenetischen Platzierungen in (B). B Phylogenetischer Baum der Anammox-Bakterien mit maximaler Wahrscheinlichkeit. Aus GS14-GC04 gewonnene Anammox-Bakterien-OTUs (97 % Identitätsgrenze) sind rot hervorgehoben. Die beiden aus AMOR-Sedimenten gewonnenen Genome sind blau hervorgehoben. Der Balken zeigt die geschätzte Sequenzdivergenz pro Rest an. Die Robustheit des Baums wurde durch 1.000-malige ultraschnelle Bootstrap-Iteration bewertet, und Bootstrap-Werte über 70 werden durch in der Legende angegebene Symbole angezeigt.

Anammox-Bakterien (hauptsächlich mit Ca. Scalinduaceae assoziiert) wurden auch in der Oxic-Zone (Abb. 2E, mit bis zu 20 µM O2) von GS14-GC04 nachgewiesen. Ein solches Vorhandensein von Anammox-Bakterien in Gegenwart von Sauerstoff wurde in GS16-GC04 (Abb. 2N), den anderen zuvor gemeldeten AMOR-Kernen [13] oder Hadal-Grabenkernen [10] nicht nachgewiesen. Obwohl frühe Bioreaktorstudien gezeigt haben, dass 1 µM O2 den Anammox-Metabolismus reversibel hemmt [45], wurden Anammox-Bakterien und -Aktivität in sauerstoffhaltigem Meerwasser mit bis zu 25 µM O2 nachgewiesen [46, 47], was durch die Assoziation mit Partikeln erleichtert werden könnte [ 48] und die Mikroumgebungen darin [49], insbesondere in Umgebungen mit hohem organischen Kohlenstoffgehalt. Partikel und besiedelte Oberflächen sind in Meeressedimenten weit verbreitet, die anoxische Mikronischen beherbergen können, um die anoxischen Lebensräume selbst in stark sauerstoffhaltigen Umgebungen erheblich zu erweitern [50, 51]. Daher könnten erhöhte anoxische Mikroumgebungen in hydrothermalen Sedimenten, die typischerweise eine größere Korngröße als typische Sedimente aufweisen (52), das Vorhandensein von Anammox-Bakterien in den oxischen Oberflächensedimenten ermöglichen. Alternativ könnten die in der Oxic-Zone nachgewiesenen Anammox-Bakterien ruhen. Dennoch bestätigt der Nachweis von Anammox-Bakterien in den Oberflächensedimenten die frühere Hypothese, dass Anammox-Bakterien, die in unterirdischen Nitrat-Ammonium-Übergangszonen gedeihen, aus Oberflächensedimenten ausgesät wurden [13].

Ammonium ist die wichtigste feste Stickstoffspezies, die in den meisten anoxischen Sedimentporenwässern der Festlandsockel und -hänge vorkommt. In diesen Sedimenten entsteht Ammonium hauptsächlich durch den Abbau von organischem Stickstoff und die dissimilatorische Nitratreduktion zu Ammonium (DNRA) und kann durch biologische Stoffwechselaktivitäten wie aerobe Ammoniakoxidation und Anammox sowie durch biologische Reassimilation verbraucht werden, wobei letztere jedoch minimal sein dürfte zu den extrem langsamen mikrobiellen Umsatzraten. Frühere Studien haben gezeigt, dass Ammoniak-oxidierende Archaeen (AOA) in der Oxic-Zone vorherrschen [29, 53] und Anammox-Bakterien in der Nitrat-Ammonium-Übergangszone [13], die möglicherweise die größten Ammoniumverbraucher in ihren Hauptnischen sind. In GS14-GC04 wurde Ammonium trotz der kontinuierlichen Freisetzung von Ammonium aus dem Abbau organischer Stoffe, wie aus den mit der Tiefe zunehmenden DIC-Konzentrationen hervorgeht (Abb. S2), erst dann nachgewiesen, wenn sowohl Nitrat als auch Nitrit aus dem Porenwasser erschöpft waren (Abb. 1B), was auf eine aktive Aktivität hindeutet Ammoniumverbrauch in den oberen 180-cm-Sedimenten. Welche Organismen den Ammoniumverbrauch im Sedimentintervall zwischen den Tiefen des Sauerstoff- und Nitratabbaus, also zwischen den primären Nischen der AOA- und Anammox-Bakterien, dominieren, ist jedoch noch unklar.

Um die relative Bedeutung von Anammox-Bakterien für den Ammoniumverbrauch besser zu verstehen, untersuchten wir zusätzlich zu den Anammox-Bakterien selbst die Verteilung (dh sowohl die relative als auch die absolute Häufigkeit) von AOA und Ammoniak-oxidierenden Bakterien (AOB) in den beiden AMOR-Kernen unter Verwendung der beiden oben beschriebenen mikrobiellen quantitativen Methoden. In Übereinstimmung mit ihrem Sauerstoffbedarf [54, 55] wurden sowohl AOA (zugehörig zur Klasse Nitrosopumilales [56, 57]) als auch AOB hauptsächlich in den oxischen Zonen (d. h. den oberen 10 cm Sedimenten von GS14-GC04) nachgewiesen (Abb. 2B, C) und die oberen 110 cm von GS16-GC04 (Abb. 2K, L)) durch 16 S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung. Während AOB mit geringer relativer Häufigkeit [<0,3 % der Gesamtgemeinschaften in GS14-GC04 (Abb. 2C) und <1,5 % in GS16-GC04 (Abb. 2L)] auf die oxischen Zonen beschränkt zu sein scheinen (Abb. 2G, P), AOA wurden nicht nur in den oxischen Zonen, sondern auch in tieferen anoxischen Sedimenten nachgewiesen (Abb. 2F, O). Die Diskrepanz der AOA-Häufigkeiten, die mit den beiden Methoden bestimmt wurden (Abb. 2F), kann auf die Möglichkeit zurückgeführt werden, dass die qPCR-Primer der AOA-AmoA-Gentests einige neue AOA-Genotypen nicht erkennen und daher die AOA-Häufigkeiten unterschätzen. Obwohl AOA das Potenzial haben, Ammonium in Abwesenheit von Sauerstoff zu Nitrit zu oxidieren [58], waren ihre Häufigkeiten im Sedimentintervall zwischen den Tiefen des Sauerstoff- und Nitratabbaus mindestens eine Größenordnung geringer als die von Anammox-Bakterien. Dies macht es plausibel, dass Anammox-Bakterien die Ammoniumkonsumenten in anoxischen Tiefen dominieren. Daher kann neben der Nitrat-Ammonium-Übergangszone [13] auch Ammonium, das beim Abbau organischer Stoffe in Sedimenten zwischen den Tiefen des Sauerstoffmangels und des Nitratabbaus von GS14-GC04 freigesetzt wird, überwiegend von Anammox-Bakterien als dissimilatorisches Substrat verbraucht werden und von allen Mikroben als ihre assimilatorische Stickstoffquelle.

Um unsere Vermutung zu untermauern, dass die dissimilatorische Nitratreduktion wahrscheinlich der Prozess der Nitritbildung in den anoxischen Sedimenten beider AMOR-Kerne war, haben wir die Häufigkeit nitratreduzierender Bakterien durch qPCR nachgewiesen und quantifiziert, die auf das narG-Gen abzielen, das für die membrangebundene Nitratreduktase-Alpha-Untereinheit kodiert. Wir haben NarG in allen Kernen entdeckt, das im Allgemeinen einen absteigenden Trend nach unten zeigte. Insbesondere haben wir bis zu 106 Kopien g-1 von narG in den obersten Sedimenten und ~104 Kopien g-1 von narG in den Nitrit-Akkumulationszonen der beiden AMOR-Kerne nachgewiesen (Abb. 2I, R), was darauf hindeutet, dass Nitratreduzierer möglicherweise vorhanden sind nutzen diesen Weg, um Nitrat zu reduzieren und so das angesammelte Nitrit zu produzieren.

Um den Beitrag von Anammox-Bakterien zum Nitritverbrauch zu bewerten, haben wir auch die gleichzeitige Verteilung von Nitrit-oxidierenden und Nitrit-reduzierenden Bakterien, den beiden anderen am Nitritverbrauch beteiligten funktionellen Gruppen, quantifiziert. Sowohl in GS14-GC04 als auch in GS16-GC04 wurde beobachtet, dass die relative Häufigkeit von NOB, die mit den Bakteriengattungen Nitrospira und Nitrospina assoziiert sind, mit der Tiefe in den flachen Sedimenten zunimmt und dann auf niedrige Werte (<0,5 % der Gesamtgemeinschaften) abnimmt Sedimente ohne nachweisbaren Sauerstoff (Abb. 2D, M). Das Vorhandensein von mutmaßlichem NOB in anoxischen Sedimenten wird auch durch die berechneten absoluten Häufigkeiten gestützt (Abb. 2H, Q). Diese Beobachtungen legen nahe, dass einige NOB über lange Zeiträume in anoxischen Sedimenten verbleiben können. Obwohl Nitrospira- und Nitrospina-NOBs metabolisch vielseitig sind [z. B. wie in [59] beschrieben], ist nicht bekannt, dass sie die Nitritoxidationsaktivität ohne Sauerstoff aufrechterhalten und sollten daher die Verteilung von Nitrit in anoxischen Sedimenten nicht wesentlich beeinflussen. Darüber hinaus war die Häufigkeit nitritreduzierender Bakterien, wie durch die absolute Häufigkeit der nirS- und nirK-Gene angezeigt, mindestens eine Größenordnung niedriger als die von Anammox-Bakterien (Abb. 2I, R). In den Nitrit-akkumulierenden Zonen beider Kerne wurden die Nitrit-reduzierenden Bakterienpopulationen von nirS-haltigen Mitgliedern dominiert (Abb. 2I, R). Im Vergleich zu den angrenzenden Schichten wiesen die Nitrit-Anreicherungszonen in beiden Kernen eher höhere als geringere Häufigkeiten von nirS auf (Abb. 2I, R), was darauf hindeutet, dass das angesammelte Nitrit nicht auf eine Abnahme der Häufigkeit von Nitritreduzierern zurückzuführen ist. Da Variationen der Genhäufigkeit jedoch nicht unbedingt Unterschiede in der Stoffwechselrate darstellen, sind künftige Geschwindigkeitsmessungen der Nitritreduktion in verschiedenen Tiefen erforderlich, um den Einfluss von Nitritreduzierern auf die Nitritverteilung in den AMOR-Sedimenten zuverlässig beurteilen zu können. Nichtsdestotrotz sind Anammox-Bakterien allein aus Gründen der Häufigkeit von entscheidender Bedeutung, da sie in der Tiefe der Nitrit-Anreicherung andere dissimilatorische Ammonium- und Nitrit-Konsumenten um mindestens eine Größenordnung übertreffen.

Um die Gründe zu klären, die zu den beiden relativen Häufigkeitsspitzen von Anammox-Bakterien in GS14-GC04 führen, untersuchten wir die Anammox-Bakteriengemeinschaft auf der Ebene einzelner OTUs (97 % Nukleotididentitäts-Cutoff). Anammox-Bakterien wurden durch 8 OTUs repräsentiert (OTU_2, OTU_6, OTU_180, OTU_571, OTU_595, OTU_602, OTU_4527 und OTU_4769) (Abb. 3A). Unter diesen Anammox-Phylotypen wurde im gesamten Sedimentkern nur OTU_2 nachgewiesen, während die anderen OTUs nur in diskreten Sedimenthorizonten nachgewiesen wurden (Abb. 3A). Die phylogenetische Analyse (Abb. 3B) ergab, dass OTU_2, OTU_571, OTU_602, OTU_4527 und OTU_4769 Mitglieder der Ca sind. Familie Scalinduaceae, wobei OTU_2 mit Ca übereinstimmt. Scalindua sediminis, ein Anammox-Bakterium, dessen Vorkommen in AMOR-Sedimenten bereits nachgewiesen wurde [13]. OTU_602 und OTU_4769 fielen in den breiten Cluster mit Ca. S. brodae [60], Ca. S. profunda [15] und Ca. S. japonica (14), drei Anammox-Anreicherungskulturen aus Küstensedimenten. Die anderen drei OTUs (OTU_6, OTU_180 und OTU_595) sind Mitglieder der neu vorgeschlagenen Anammox-Bakterienfamilie Ca. Bathyanammoxibiaceae [16] und Cluster mit unkultivierten Anammox-Bakterien aus dem AMOR-Gebiet [13] und anderen Orten wie dem Südchinesischen Meer [61] (Abb. 3B). Analysen der Identität und Verteilung von Anammox-Bakterien in GS16-GC04 wurden bereits an anderer Stelle beschrieben [16], in denen Mitglieder beider Familien von Ca. Scalinduaceae und Ca. Es wurden auch Bathyanammoxibiaceae gefunden.

Anammox-Bakterien der beiden Familien weisen in beiden AMOR-Kernen deutlich unterschiedliche Verteilungsmuster auf. In GS14-GC04, Ca. Scalinduaceae machten 7 % der Gesamtgemeinschaft im flachsten Sediment aus und nahmen mit der Tiefe ab, bis sie im Intervall von 120–220 cm wieder zunahmen, wobei der Höhepunkt (18 % der Gesamtgemeinschaft) bei 160 cm festgestellt wurde (Abb. 4A). Ca. Bathyanammoxibiaceae zeigte den gegenteiligen Trend. Diese Familie war in den beiden obersten untersuchten Sedimentschichten nicht nachweisbar, nahm jedoch in den oberen Sedimenten zu und erreichte den Höhepunkt (11 % der Gesamtgemeinschaft) bei 50 cm, bevor sie in tieferen Schichten auf niedrige Werte abnahm (Abb. 4A). Im GS16-GC04, Ca. Scalinduaceae besetzten das Intervall von 125–170 cm (dh den oberen Teil der Nitrat-Ammonium-Übergangszone), während Ca. Bathyanammoxibiaceae war auf das Intervall von 170–220 cm (dh den unteren Teil der Nitrat-Ammonium-Übergangszone) beschränkt (Abb. 4C). Eine solche in GS16-GC04 beobachtete Verteilung der Anammox-Bakterienfamilien war auch in GS16-GC05 (Abb. S5) sichtbar, einem weiteren zuvor in [13] beschriebenen AMOR-Kern, in dem schwache Signale für das Vorhandensein von Nitrit im Intervall von 50–60 cm vorhanden waren während der Messungen an Bord festgestellt, aber nicht quantifiziert. Diese Beobachtungen in den AMOR-Kernen liefern den ersten Beweis für eine Nischenaufteilung (Handel zwischen dominanten Familien) zwischen den beiden Anammox-Bakterienfamilien in der Meeresumwelt.

Relative Häufigkeit der Anammox-Familien (Ca. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae) in den Kernen GS14-GC04 (A) und GS16-GC04 (C), ermittelt durch 16-S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung. Absolute Häufigkeiten der beiden Anammox-Familien in den Kernen GS14-GC04 (B) und GS16-GC04 (D), berechnet als Produkt der Gesamtzahl der Zellen multipliziert mit ihrer relativen Häufigkeit in den Gesamtgemeinschaften. Die Panels (C, D) sind aus Referenz neu dargestellt. [16].

Die Unterscheidung der beiden Anammox-Bakterienfamilien ist hilfreich, um ihre jeweilige Rolle beim Nitritverbrauch besser beurteilen zu können. Durch die Berechnung der absoluten Häufigkeiten von Ca. Scalinduaceae und Ca. Bei den Bathyanammoxibiaceae ist klar, dass ihre absoluten Häufigkeitsspitzen gut mit den beiden Netto-Nitritverbrauchszonen oberhalb und unterhalb der Nitritkonzentrationsmaxima in GS14-GC04 (Abb. 4B) und GS16-GC04 (Abb. 4D) übereinstimmen, was darauf hindeutet, dass sie wahrscheinlich sind trägt wesentlich zum lokalen Nitritverbrauch bei. In den anderen beiden AMOR-Kernen (GS14-GC08 und GS14-GC09), in denen keine Nitritanreicherung gefunden wurde [13], gibt es keine klare Nischenaufteilung zwischen Ca. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae können beobachtet werden [16]. Dieser Vergleich einer kleinen Anzahl von AMOR-Kernen lässt auf ein gleichzeitiges Auftreten zwischen der Nitritakkumulation und der Nischenaufteilung zwischen den beiden Anammox-Bakterienfamilien in AMOR-Sedimenten schließen. Während die anoxischen Tiefen mit geringer Häufigkeit von Anammox mit der Nitritakkumulation zusammenfallen und zwischen den Spitzen der beiden Familien liegen, muss die vollständige Dynamik, die zur Nischentrennung der beiden Anammox-Bakterienfamilien führt, durch weitere Untersuchungen geklärt werden.

Hinsichtlich der Verteilung der beiden Anammox-Bakterienfamilien scheint zwischen GS14-GC04 und den anderen beiden Kernen (GS16-GC04 und GS16-GC05) ein gegensätzlicher Trend zu bestehen: Ca. Bathyanammoxibiaceae besetzten die obere Nitritverbrauchszone von GS14-GC04, aber die unteren von GS16-GC04 und GS16-GC05 (Abb. 4B, D und S5). Die Diskrepanz zwischen diesen Kernen kann jedoch durch die unzureichende Kernbildung von GS14-GC04 verursacht werden. Obwohl sich das relative Häufigkeitsprofil (Abb. 4A) nicht leicht widerspiegeln lässt, ist Ca. Bathyanammoxibiaceae in GS14-GC04 zeigten eine Zunahme der absoluten Häufigkeit mit der Tiefe (einschließlich der unteren Nitritverbrauchszone) in Richtung tieferer Sedimente (Abb. 4B). Es ist möglich, dass seine Dominanz in tieferen Sedimenten nicht gut geklärt wurde, da erst der Beginn von Ca. Bathyanammoxibiaceae in den tiefen ammoniumhaltigen Sedimenten wurden gefangen (Abb. 4B). Daher spekulieren wir in den hier untersuchten AMOR-Kernen, dass Ca. Bathyanammoxibiaceae bevorzugen wahrscheinlich Bedingungen mit höherer Ammoniumverfügbarkeit und Ca. Scalinduaceae niedrigere Ammoniumbedingungen.

Eine geringe Aktivität von Mikroben in unterirdischen Sedimenten führt zu langen Generationszeiten und kann den Evolutionsprozess der Population verlängern. Die beobachteten Häufigkeitsmaxima der beiden Anammox-Bakterienfamilien in GS14-GC04 und GS16-GC04 lagen durch Sedimentation von ~110 cm bzw. 45 cm voneinander entfernt (Abb. 4). Angesichts der Sedimentationsrate von ~2 cm ky−1 in diesem Bereich [62] kann die maximale Dauer der Nischenaufteilung zwischen den beiden Anammox-Familien in den beiden AMOR-Kernen auf etwa 55.000 Jahre geschätzt werden. Der teilweise Zusammenbruch der gesamten Anammox-Bakterienpopulation in GS14-GC04, der während dieses längeren Prozesses der Nischenaufteilung beobachtet wurde (Abb. 2E), kann durch die Veränderungen der beiden wesentlichen Substrate von Anammox-Bakterien verursacht werden: Nitrit und Ammonium. Die folgenden beiden Beobachtungen sprechen jedoch gegen das Szenario, dass der leichte Anstieg von Nitrit in der Nitrit-Akkumulationszone die Aktivität bzw. Häufigkeit von Anammox-Bakterien stark beeinflussen kann. Erstens ist es angesichts der Beobachtung, dass die Häufigkeit von Anammox-Bakterien in den niedrigen Nitrittiefen höher, in den hohen Nitrittiefen jedoch geringer war (Abb. 2A, E), unwahrscheinlich, dass die gemessenen Nitritkonzentrationen zu niedrig sind, um die nachgewiesenen Anammox-Bakterien zu befeuern. Zweitens sind die höchsten in GS14-GC04 gemessenen Nitritkonzentrationen (3,3 µM) viel niedriger als die gemeldeten mM-Werte an tolerierbarem Nitrit durch Anammox-Bakterien (z. B. 7,5 mM für Ca. S. japonica [63], 2,1 mM für Ca. Kuenenia stuttgartiensis [64] und 6 mM für aus Abwasserschlamm angereicherte Anammox-Bakterien [65]), was darauf hindeutet, dass die lokalen Nitritkonzentrationen die Anammox-Bakterien nicht hemmen sollten. Stattdessen ist eine verringerte Ammoniumversorgung ein plausibler Faktor, der für den teilweisen Zusammenbruch der Anammox-Bakterienpopulation verantwortlich ist. Im Vergleich zur Nitratverarmungszone können flachere Sedimente aufgrund der höheren Abbauraten organischer Substanz eine höhere Ammoniumversorgung erhalten, während tiefere Sedimente aufgrund der Aufwärtsdiffusion von Ammonium aus tieferen anoxischen Sedimenten möglicherweise auch eine höhere Ammoniumversorgung aufweisen. Das geringere Ammoniumangebot in der Nitrit-Akkumulationszone hat möglicherweise die Anammox-Population in GS14-GC04 begrenzt und daher die Nitrit-Akkumulation aufrechterhalten. Im Vergleich zu GS16-GC04 weist GS14-GC04 eine höhere Nitritakkumulation auf (Abb. 1C), eine größere vertikale Aufteilung zwischen den Anammox-Familien (Abb. 4) und einen deutlichen Zusammenbruch der Anammox-Population (Abb. 2N). Dies wird auf die längere Trennung zwischen Nitrat und Ammonium zurückgeführt (Abb. 1B). Anders als bei GS14-GC04 wird Ammonium, das aus tiefen Sedimenten von GS16-GC04 diffundiert, nicht nur in der unteren Nitritverbrauchszone verbraucht, sondern kann auch in die Nitritakkumulationszone gelangen (Abb. 1C) und die dort ansässigen Anammox-Bakterien unterstützen. Mit anderen Worten: Wenn die beiden verschiedenen Ammoniumquellen zu weit voneinander entfernt sind, um Anammox in der Mitte zu unterstützen, kann sich Nitrit ansammeln, mit tiefgreifenderen Auswirkungen bei GS14-GC04 als bei GS16-GC04. Aufgrund der Abhängigkeit von der vertikalen Trennung zwischen Nitrat und Ammonium sollte sich umso mehr Nitrit ansammeln, je weiter diese beiden Nährstoffe gespalten sind, wie bei GS14-GC04 vs. GS16-GC04 beobachtet wird.

Angesichts des Mangels an Anammox-Kulturen aus pelagischen Meeressedimenten haben wir uns auf eine vergleichende Genomanalyse verlassen, um mögliche (und wahrscheinliche) Gründe zu identifizieren, die zur Nischenaufteilung zwischen den beiden Anammox-Bakterienfamilien in AMOR-Sedimenten führen. Voraussetzung für eine solche Analyse sind qualitativ hochwertige Genome. Obwohl Ca. Scalindua sediminis [13] ist ein hochwertiger Vertreter der Ca. Scalinduaceae-Familie, das frühere Metagenom-assemblierte Genom (MAG) von Ca. Es wurde geschätzt, dass Bathyanammoxibiaceae in AMOR-Sedimenten, Bin_158, nur zu 74 % vollständig waren [16]. Um daher qualitativ hochwertige repräsentative Genome von Ca zu erhalten. Bathyanammoxibiaceae in AMOR-Sedimenten führten wir eine Metagenomsequenzierung am Sedimenthorizont GC05_55cm durch, da Ca. Durch 16 S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung wurde festgestellt, dass Bathyanammoxibiaceae in dieser Sedimentschicht 28 % der gesamten prokaryotischen Gemeinschaft ausmachen [16]. Durch Metagenomassemblierung und Binning erhielten wir ein hochwertiges MAG (96,6 % Vollständigkeit und 1,5 % Redundanz), das mit Ca verbunden ist. Bathyanammoxibiaceae. Die Contigs dieses MAG weisen höhere Guanin-Cytosin (GC)-Gehalte auf als das gleichzeitig vorkommende Ca. Scalindua sediminis (Abb. 5A und S6) und kann daher zuverlässig unterschieden werden. Dieses MAG ist 2,1 Megabasenpaare groß, kleiner als Anammox-Bakterien anderer Familien (Abb. 5A) und verfügt über 1905 kodierende Gene, die auf 32 Gerüsten verteilt sind. Es hat eine durchschnittliche Nukleotididentität von 98 % mit Bin_158, das zuvor aus dem GS14-GC08-Kern gewonnen wurde [16], und kann daher als dieselbe Anammox-Bakterienart angesehen werden, die nachweislich in AMOR-Sedimenten vorherrscht. Es hat ein ribosomales Operon und das 16 S rRNA-Gen (1.334 bp) stimmt zu 100 % mit OTU_6 von GS14-GC04 überein, das hier dargestellt ist (Abb. 3B) und mit OTU_23 der vier zuvor charakterisierten AMOR-Kerne (16), was darauf hinweist dass es den dominantesten Bathyanammoxibius-Phylotyp in diesen AMOR-Kernen darstellen kann. Es enthält auch alle notwendigen Gene für den zentralen Anammox-Metabolismus, einschließlich Hydrazin-Synthase (obwohl sich die Alpha-, Beta- und Gamma-Untereinheiten an den Enden zweier getrennter Contigs befinden), Hydrazin-Dehydrogenase und Nitrit-Oxidoreduktase. Wir nennen dieses MAG vorläufig Candidatus Bathyanammoxibius amoris (benannt nach AMOR, dem Ursprungsort dieses MAG).

AA-Diagramm der Genomgröße gegen den GC-Gehalt der drei Familien der Anammox-Bakteriengenome. Ca. Bathyanammoxibius amoris (in dieser Studie) und Ca. Scalindua sediminis (Ref. [13]), Vertreter der Familien Ca. Bathyanammoxibiaceae und Ca. Scalinduaceae, die in Meeressedimenten weit verbreitet sind, werden hervorgehoben. B Venn-Diagramm, das die gemeinsamen und einzigartigen Gencluster zwischen Ca zeigt. B. amoris und Ca. S. sediminis.

Mit Ca. S. sediminis und Ca. B. amoris als repräsentative Genome des Ca. Scalinduaceae und Ca. Da sich gezeigt hat, dass die Familien der Bathyanammoxibiaceae in diesem System dominieren, führten wir eine vergleichende Genomanalyse durch, um mögliche Gründe zu identifizieren, die zur Nischenaufteilung zwischen den beiden Anammox-Bakterienfamilien in AMOR-Sedimenten führen könnten. Die beiden Genome zusammen enthalten 4808 Gene, zusammengefasst in 1548 Genclustern, von denen 917 von den beiden Genomen gemeinsam genutzt werden (Abb. 5B). Von den verbleibenden 631 Genclustern sind 457 in Ca einzigartig. S. sediminis und die anderen 174 Gencluster sind in Ca einzigartig. B. amoris (Abb. 5B). Da es sich bei beiden um Anammox-Genome handelt, gehören Gene, die für die Schlüsselenzyme des Anammox-Kernstoffwechsels kodieren, zu den gemeinsamen Genclustern (im Ergänzungsdatensatz S2 enthalten). Im Vergleich zu Ca. Scalindua sediminis [13], Ca. B. amoris fehlt Urease und Cyanase (Abb. 5B), was darauf hindeutet, dass es nicht in der Lage ist, Energie zu sparen oder durch den Abbau von Harnstoff und Cyanat zusätzliches Ammonium zu produzieren. Obwohl die Verfügbarkeit von Cyanat in Meeressedimenten nicht bestimmt wurde, wurden Harnstoffkonzentrationen gemessen, die achtmal niedriger waren als die von Ammonium [66, 67]. Der Großteil der Harnstoffproduktion in anoxischen Sedimenten ist auf den mikrobiellen Abbau [68] von Purinen und Pyrimidinen zurückzuführen [69], während in oxischen Sedimenten gegebenenfalls auch Makrofauna eine Rolle bei der Harnstoffproduktion spielen kann [70]. Die Harnstoffhydrolysekapazität kann Ca liefern. S. sediminis hat einen Wettbewerbsvorteil, wenn es darum geht, in Umgebungen mit begrenztem Ammoniumgehalt zu leben, beispielsweise in oxischen Sedimenten an der Oberfläche (Abb. 4A, B). Ca. B. amoris fehlt auch Thiosulfatreduktase, ein Enzym, das in Ca vorhanden ist. S. sediminis und auch einige andere Anammox-Bakterien [71], die es ihnen ermöglichen könnten, Thiosulfat als Elektronenakzeptor zu nutzen. Einzigartige Gene in Ca vorhanden. B. amoris umfasst Gene, die für Laktatdehydrogenase, Pyruvat:Ferrodoxin-Oxidoreduktase und [NiFe]-Hydrogenase kodieren (Abb. 5B), die alle an der Fermentation beteiligt sein können.

Angesichts der Tatsache, dass die beobachteten Ammoniumkonzentrationen zwischen den beiden Nischen der Anammox-Bakterien stark unterschiedlich sind, untersuchten wir die Art und Anzahl der Ammoniumtransporter (Amt) – des wesentlichen Zellapparats für die Ammoniumassimilation, der in allen Lebensbereichen konserviert ist – in verfügbaren hochwertigen Anammox-Bakterien Genome. Wir haben insgesamt 55 Amt unter den 10 ausgewählten hochwertigen Anammox-Genomen identifiziert. Die phylogenetische Analyse von Amt legte nahe, dass Anammox-Bakterien Amt sowohl vom Rh-Typ als auch vom MEP-Typ enthalten (Abb. 6A). Wir identifizierten eine Klade von Anammox Amt im Zweigcluster vom Rh-Typ mit denen von AOB und Nitrospira NOB (72) und 6 Anammox-Amt-Kladen im Zweig vom MEP-Typ (Abb. 6A). Es wurde gezeigt, dass Transporterproteine ​​vom Rh-Typ in AOB [73, 74] und anderen Organismen [75] eine geringe Ammoniumaffinität aufweisen und nur bei hohen Ammoniumkonzentrationen im millimolaren Bereich funktionsfähig sind, während Ammoniumtransporter vom MEP-Typ eine höhere Affinität aufweisen [76]. , 77] und kann unter Bedingungen niedriger Ammoniumkonzentrationen effizient sein. Ein Amt vom Rh-Typ mit geringer Affinität ist in den Genomen der Familien Ca konserviert. Brocadiaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae, scheinen aber in Ca nicht vorzukommen. Scalinduaceae (Abb. 6B). Für die hochaffinen Amt-Anammox-Bakterien vom MEP-Typ im Ca. Die Familie der Scalinduaceae hat zwischen vier und acht, während Ca. Mitglieder der Bathyanammoxibiaceae verfügen nur über 2–5 dieser Ammoniumtransporter (Abb. 6B). In Kombination mit dem fehlenden Zugang zu alternativen Substraten und zusätzlichem Ammonium kodieren weniger hochaffine Ammoniumtransporter in Ca. Bathyanammoxibiaceae als Ca. Scalinduaceae treiben möglicherweise erstere voran und bewohnen nur Bedingungen mit hohen Konzentrationen oder Flüssen von Ammonium, was durch die beobachtete Präferenz von Ca gestützt wird. Bathyanammoxibiaceae in Sedimentschichten mit (beobachteter oder vermuteter) höherer Ammoniumverfügbarkeit.

Ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit von Amt in Anammox-Bakterien und anderen verwandten Stickstoffkreislaufgruppen (AOB, NOB und AOA). Amt-Klassen von Stickstoffkreislaufgruppen werden mit verschiedenen Farben hervorgehoben. Der Balken zeigt die geschätzte Sequenzdivergenz pro Rest an. B Heatmap, die das Vorkommen von Amt in 10 ausgewählten hochwertigen Anammox-Bakteriengenomen zeigt.

Die genombedingte Präferenz höherer Ammoniumverfügbarkeiten für Ca. Bathyanammoxibiaceae steht auch im Einklang mit der jüngsten phylogenomischen und molekularen Uhranalyse von Anammox-Bakterien [78]. In dieser Arbeit wurde gefolgert, dass Anammox-Bakterien auf der Erde um das Große Oxidationsereignis entstanden sind [78], vor dem Ammonium die dominierende ozeanische Stickstoffspezies war [1]. Ca. Bathyanammoxibiaceae ist tiefer verzweigt als Ca. Scalinduaceae, die besser an die ursprünglichen Bedingungen (z. B. hohe Ammoniumkonzentrationen) der Anammox-Bakterien angepasst sein könnten.

Es ist erwähnenswert, dass in dieser Studie mikrobiologische Daten von nur zwei der 30 Sedimentstandorte analysiert wurden, die eine Nitritanreicherung aufweisen, und ob der hier vorgeschlagene Mechanismus für die AMOR-Sedimente auf andere globale Standorte im weiteren Sinne anwendbar ist, bleibt unklar. Der Schlüssel für diese Beurteilung sind tiefenaufgelöste mikrobiologische Daten. Obwohl mikrobielle Gemeinschaften in einigen der 28 Literaturstellen charakterisiert wurden, insbesondere in denen aus dem Atacama-Graben [10, 79], sind mindestens zwei Unterschiede zwischen diesen Atacama-Grabenkernen und den beiden hier untersuchten AMOR-Kernen erkennbar. (i) Die relativen Häufigkeitsmaxima von Anammox-Bakterien in Hadal-Grabensedimenten (maximal 5 % der Gesamtgemeinschaften; [10]) sind viel niedriger als die in AMOR-Kernen (maximal 15 % der Gesamtgemeinschaften; Abb. 2). (ii) Die Formen der Nitritprofile sind unterschiedlich. Während die oberen Nitritverbrauchszonen in beiden AMOR-Kernen gut von der oxischen Zone getrennt sind (Abb. 1B, C), wurde im oberen Teil, einschließlich der oxischen Zone einiger Kerne des Atacama-Grabens (z. B. AT1, AT3), häufig Nitrit nachgewiesen , AT4, AT6 und AT7; Abb. S3), was darauf hindeutet, dass aerobe Prozesse eine Rolle bei der Erzeugung oder dem Abbau von Nitrit in flachen Sedimenten dieser Grabenkerne spielen könnten. Solche Unterschiede sind an diesen unterschiedlichen Standorten zu erwarten, die jeweils durch unterschiedliche Tiefe, unterschiedliche organische Substanz und Nährstoffversorgung sowie Sedimentationsrate gekennzeichnet sind. Mikrobiologische Untersuchungen weiterer Sedimentkerne sind erforderlich, um ein umfassenderes Verständnis der mikrobiellen Prozesse zu entwickeln, die der beobachteten Nitritakkumulation in Meeressedimenten zugrunde liegen.

Wir haben biogeochemische, mikrobiologische und genomische Daten kombiniert, um Anammox-Bakterien und ihre geochemischen Auswirkungen in Meeressedimenten zu untersuchen. Wir haben herausgefunden, dass die Anammox-Gemeinschaft aus Mitgliedern beider Familien Ca. bestand. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae und dokumentierten eine Nischenaufteilung zwischen ihnen in zwei Sedimentkernen, die vom arktischen Mittelozeanischen Rücken entnommen wurden. Diese Kerne zeigten eine Nitrit-Anreicherung rund um die Nitrat-Verarmungszonen, ein analoges Merkmal, das auch in 28 anderen global verteilten Meeressedimentkernen und in anderen geschichteten aquatischen Umgebungen beobachtet wurde. Das angesammelte Nitrit wird hauptsächlich von Nitratreduzierern produziert und reichert sich aufgrund der Begrenzung von Ammonium für Anammox-Bakterien und Nitritreduzierer an. Die beobachtete Nitritakkumulation in den AMOR-Sedimentkernen geht mit der Nischenaufteilung zwischen den beiden Anammox-Bakterienfamilien einher, in denen Ca. Bathyanammoxibiaceae und Ca. Scalinduaceae weisen Bedingungen mit höherem bzw. niedrigerem Ammoniumgehalt auf. Diese Nischenaufteilung ist wahrscheinlich auf die unterschiedlichen Kapazitäten bei der Ammoniumassimilation und der Verwendung alternativer organischer Stickstoffsubstrate wie Harnstoff und Cyanat zurückzuführen. Zukünftige Bemühungen zur Entwicklung mechanistischer Modelle, die die beobachteten geochemischen und mikrobiologischen Daten erklären und gleichzeitig die Sedimentationsgeschichte in Einklang bringen können, werden unser Verständnis der Wechselwirkungen zwischen den Stickstoffkreislaufprozessen in Meeressedimenten erheblich verbessern.

Candidatus Bathyanammoxibius amoris. Bathyanammoxibius amoris (a.mo'ris, NL gen. mask, n. amoris von AMOR, abgeleitet vom ozeanografischen Standort (Arctic Mid-Ocean Ridge, AMOR), wo dieses Bakterium häufig vorkommt). Das Genom weist eine Aminosäureidentität von 98,8 % mit dem zuvor berichteten Bathyanammoxibius Bin_158 auf [16], ist jedoch vollständiger (96,6 % im Vergleich zu 72,4 %). Es enthält essentielle Gene für Schlüsselenzyme des Anammox-Stoffwechsels, wie Hydrazin-Synthase, Hydrazin-Dehydrogenase, Nitrit-Oxidoreduktase, Hydroxylamin-Oxidoreduktase. Im Genom wurden keine Urease- oder Cyanase-Gene entdeckt. Die Genomreferenzsequenz von Candidatus Bathyanammoxibius amoris ist JAMXCW000000000. Dieses Genom wurde aus dem Kern GS16-GC05 (55 cm unter dem Meeresboden) des zentralen Knipovich-Rückens (76°55' N, 7°7,5' E) gewonnen. Der G + C-Gehalt im Genom beträgt 52,36 %.

In dieser Studie wurden zwei Kerne mit demselben Probenahme- und Analyseverfahren untersucht, obwohl sie während zweier unterschiedlicher Kreuzfahrten gesammelt wurden. GS14-GC04 (71o17,08'N, 6o33,69'W) wurde während der CGB-Sommerkreuzfahrt 2014 an Bord des norwegischen R/V GO Sars mithilfe eines Schwerkraftkernbohrers vom Meeresboden in einer Wassertiefe von 1050 Metern geborgen. Diese Bohrstelle liegt etwa 50 km westlich des hydrothermalen Entlüftungsfeldes Jan Mayen [71,2°N, 5,5°W, [19, 20]] und nördlich der Jan-Mayen-Fraktionszone (Abb. 1A). GS16-GC04 wurde mit der gleichen Methode an der Ostflanke des zentralen Mohns Ridge (72o16' N, 1o42' E) geborgen. Wie an anderer Stelle beschrieben [13], wurden die geborgenen Kerne an Deck in zwei Hälften geteilt. Eine Hälfte wurde sofort zur Archivierung bei 4 °C im Kernlager der Universität Bergen in Plastikfolie eingewickelt, die andere Hälfte wurde für die Probenahme auf dem Deck verwendet. Zunächst wurden die Sauerstoffkonzentrationen mithilfe einer Optode gemessen, indem der Sensor in den mittleren Teil ausgewählter Tiefen in der Arbeitshälfte abgesenkt wurde. Die Optodensensoren wurden an ein einkanaliges faseroptisches Sauerstoffmessgerät MICROX TX3 angeschlossen, das gemäß den Protokollen des Herstellers (PreSens, Regensberg, Deutschland) kalibriert wurde. Zweitens wurde Porenwasser mit Rhizon-Probenehmern [80] aus diskreten Tiefen entnommen. Mikrobiologische Teilproben wurden gleichzeitig mit der Porenwasserextraktion unter Verwendung steriler 10-ml-Abschneidespritzen aus nahezu identischen Tiefen wie bei der Porenwasserextraktion entnommen und sofort bei –80 °C für die DNA-Analyse an Land eingefroren.

Geochemische Analysen wurden nach dem gleichen Verfahren wie in [13] durchgeführt. An Bord wurden die Nährstoffkonzentrationen im Porenwasser gemessen. Die Konzentrationen von Ammonium (NH4+), Nitrat (NO3–), Nitrit (NO2–) und gelöstem anorganischem Kohlenstoff (DIC) wurden kolorimetrisch mit einem QuAAtro-Kontinuierlichen Durchflussanalysator (SEAL Analytical Ltd, Southampton, UK) gemäß dem Protokoll des Herstellers analysiert. Für die Ammoniummessung wurde die photometrische Indophenol-Methode verwendet [81]. Nitrit wurde nach Reaktion mit N-1-Naphthylethylendiamin-Dihydrochlorid und Sulfanilamid als rosafarbener Komplex gemessen. Die Summe von Nitrat und Nitrit im Porenwasser wurde mit der gleichen Methode gemessen, nachdem Nitrat mit einer Cu-Cd-Reduktionsspule zu Nitrit reduziert wurde [82]. Die Nitratkonzentrationen wurden als Differenz zwischen diesen beiden Messungen berechnet. Das Protokoll für DIC basierte auf [83]. Porenwasserproben zur Bestimmung der Metallkonzentrationen (einschließlich gelöstem Mn und Fe) wurden mit hochreiner Salpetersäure auf eine Endkonzentration von 3 Vol.-% angesäuert und bis zur Analyse in mit Säure gereinigten Flaschen bei 4 °C gelagert. Die Metallkonzentrationen wurden mit dem Thermo Scientific iCap 7600 ICP-AES (induktiv gekoppelte Plasma-Atomemissionsspektrometrie) an der Universität Bergen bestimmt. Für die Messung des gesamten organischen Kohlenstoffs (TOC) und Stickstoffs (TON) wurden die Sedimente zunächst 24 Stunden lang bei 95 °C getrocknet und dann auf einem Elementanalysator (Analytikjena multi EA4000, Jena, Deutschland) gemessen, nachdem anorganischer Kohlenstoff durch Zugabe von 1 ml entfernt wurde Phosphorsäure.

Diffusionsflüsse von Nitrat in und Nitritausflüsse (sowohl nach oben als auch nach unten) aus der Nitratverarmungszone in Sedimentkernen wurden auf der Grundlage der gemessenen Profile unter Verwendung des ersten Diffusionsgesetzes von Fick berechnet:

wobei J der Fluss ist; φ ist die gemessene Sedimentporosität; Ds ist der Sedimentdiffusionskoeffizient für einen bestimmten gelösten Stoff (m2 Jahr−1), berechnet mit dem R-Paket marelac [84]; z ist die Sedimenttiefe unter dem Meeresboden (m); und ∂[C]/∂z entspricht dem Konzentrationsgradienten des gelösten Stoffes (NO3– oder NO2–) (mmol m−4), berechnet aus drei nahe beieinander liegenden Datenpunkten. Das Verhältnis von Nitrit- zu Nitratfluss wurde berechnet, indem die Summe der aufwärts und abwärts gerichteten Nitritflüsse durch den (abwärts gerichteten) Nitratfluss dividiert wurde. Der Mittelwert und das 95 %-Konfidenzintervall dieses Verhältnisses an den 30 Sedimentstandorten wurden in R berechnet.

Die Gesamt-DNA für die Amplikon-Sequenzierung und qPCR wurde aus ca. 0,5 g Sediment pro Probe mit den PowerLyze-DNA-Extraktionskits (MO BIO Laboratories, Inc.) mit den folgenden geringfügigen Modifikationen extrahiert: (1) Lyseröhrchen wurden durch G2-Röhrchen (Amplikon, Odense, Dänemark) und (2) Wasserbad für 30 Minuten bei 60 °C vor dem Schlagen der Perlen (Geschwindigkeit 6,0 für 45 Sekunden) unter Verwendung eines FastPrep-24-Instruments (MP Biomedicals). Parallel zur Probenextraktionscharge wurde nach dem gleichen Verfahren eine Blindextraktion (ohne Sedimentzugabe) durchgeführt. Die DNA wurde in 80 µL doppelt destilliertes H2O (ddH2O) in Molekularqualität eluiert und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert. Amplikonbibliotheken von 16 S-rRNA-Genen wurden unter Verwendung des Primerpaars 519 F/806 R in einer Zwei-Runden-Amplikonstrategie [13] erstellt, mit einer optimalen PCR-Zykluszahl in der ersten Runde für jede Probe, um eine Überamplifikation zu minimieren. Amplikonbibliotheken wurden auf einer Ion Torrent Personal Genome Machine sequenziert.

Sequenzierungsablesungen wurden qualitätsgefiltert und mithilfe der USEARCH-Pipeline (85) auf 220 bp gekürzt, und Chimären wurden mithilfe von UCHIME erkannt und entfernt. Zugeschnittene Lesevorgänge wurden mithilfe von UPARSE in operative Taxonomieeinheiten (OTUs) mit einer Nukleotidsequenzidentität von> 97 % geclustert (86). Die meisten der in den Extraktionsrohlingen (Negativkontrollen) nachgewiesenen OTUs wurden manuell entfernt, mit Ausnahme einiger weniger OTUs, die durch Kreuzkontamination in die Rohlinge gelangt sein könnten. Insgesamt wurden >99,9 % der Messwerte der Negativkontrollen entfernt. Die Proben wurden für jeden Sedimenthorizont auf 20.000 Messwerte unterbeprobt. Die taxonomische Klassifizierung von OTUs wurde unter Verwendung des im CREST-Paket [87] implementierten niedrigsten gemeinsamen Vorfahrenalgorithmus mit der SILVA 138.1-Version als Referenz durchgeführt. Die relative Häufigkeit von Anammox-Bakterien wurde als Gesamtprozentsatz der mit den Familien Ca verbundenen OTUs angenommen. Scalinduaceae und Ca. Bathyanammoxibiaceae [16]. Die Verteilung einzelner Anammox-OTUs wurde in Heatmaps visualisiert, die mit dem R-Paket ggplot2 erstellt wurden [88].

Die Häufigkeit von Anammox-Bakterien wurde mithilfe von qPCR quantifiziert, indem das hzo-Gen (das für die Hydrazindehydrogenase kodiert, die für den Abbau von Hydrazin zu N2 verantwortlich ist) unter Verwendung des Primerpaars hzoF1/hzoR1 [89] nach dem an anderer Stelle beschriebenen Verfahren gezielt wurde [29]. Die Häufigkeit denitrifizierender Bakterien wurde quantifiziert, indem auf die Gene narG (kodierend für die periplasmatische Nitratreduktase-Alpha-Untereinheit), nirS und nirK (kodierend für Cytochrom-cd1- bzw. Cu-haltige Nitritreduktasen) abgezielt wurde, wobei das in [29] beschriebene Protokoll verwendet wurde. Die qPCR-Standards dieser funktionellen Gene wurden durch PCR-Amplifikation von DNA-Extrakten von Umweltproben unter Verwendung der entsprechenden qPCR-Primer hergestellt. Für hzo- und narG-Gene wurden die DNA-Extrakte eines marinen Sedimenthorizonts (160 cm Kern GS14-GC08 [13]) verwendet, während für nirS- und nirK-Gene eine arktische Permafrostbodenprobe verwendet wurde. Nach der Reinigung wurden die PCR-Produkte mit dem StrataClone PCR Cloning Kit (Agilent Technologies, USA) kloniert, einschließlich Ligation in Vektoren und Transformation in kompetente Zellen von Escherichia coli DH5α. Die transformierten E. coli-Zellen wurden auf LB-Festmedium ausplattiert und über Nacht für die blau/weiße Kolonieselektion gezüchtet. Für jedes Gen wurde eine weiße Kolonie ausgewählt und unter Verwendung der Vektorprimer M13F/M13R amplifiziert, um lineare qPCR-Standards zu erzeugen. Darüber hinaus wurden archaeale und bakterielle 16 S-rRNA-Gene wie in [90] beschrieben quantifiziert. Die qPCR-Standards für die Quantifizierung des archaealen und bakteriellen 16 S-rRNA-Gens waren genomische DNA von Thaumarchaeota-Fosmid 54d9 (AJ627422) bzw. E. coli. Die Gesamtzellhäufigkeit wurde anhand von 16 S-rRNA-Genkopien geschätzt, wobei von einer einzelnen Kopie von 16 S-rRNA-Genen in jedem bakteriellen oder archaealen Genom ausgegangen wurde (53). Alle Genhäufigkeiten wurden dreifach in qPCR bestimmt und Standardabweichungen werden mithilfe horizontaler Fehlerbalken dargestellt. Die absoluten Häufigkeiten der oben genannten Gruppen wurden auch als Produkt der gesamten Zellhäufigkeit und des durch Amplikonsequenzierung ermittelten Prozentsatzes dieser Gruppen in der Gesamtgemeinschaft berechnet.

Zur Wiederherstellung hochwertiger Genome (>90 % Vollständigkeit und <5 % Redundanz) von Ca. Bathyanammoxibiaceae konzentrierten wir uns auf den Sedimenthorizont von 55 cm des Kerns GS16-GC05, da unsere vorherige Untersuchung ergab, dass dieser spezielle Sedimenthorizont die höchste relative Häufigkeit von Ca beherbergt. Bathyanammoxibiaceae in der gesamten Archaeen- und Bakteriengemeinschaft [16]. Wir extrahieren die Gesamt-DNA aus 6,4 g Sediment (~0,4–0,6 g Sediment in jeder der 12 einzelnen Lysen) mithilfe von PowerLyze DNA-Extraktionskits (MO BIO Laboratories, Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die DNA-Extrakte wurden zur weiteren Analyse iterativ aus den 12 Spin-Säulen in 100 µL ddH2O eluiert.

Shotgun-Metagenombibliotheken wurden mit einem NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit (New England Laboratories) erstellt und auf einem NextSeq 500-Sequenzierer (Illumina) am MIT BioMicro Center sequenziert (2 × 150 bp gepaartes Ende). Die Qualität der Lesevorgänge und das Vorhandensein von Adaptersequenzen wurden zunächst mit FastQC v.0.11.9 überprüft [91]. Adapter wurden entfernt und Lesevorgänge mithilfe von BBDuk, das im BBMap-Paket implementiert ist, gekürzt [92]. Die Gesamtqualität der verarbeiteten Lesevorgänge wurde in einer abschließenden Prüfung mit FastQC v.0.11.9 [91] bewertet, um sicherzustellen, dass nur Lesevorgänge von hoher Qualität (d. h. mit einer Mindestlänge von 50 bp und einem Phred-Qualitätsfaktor von mehr als 30) erfolgten in der nachgelagerten Analyse verwendet. Die qualitätskontrollierten Lesevorgänge wurden de novo mit Megahit v.1.1.2 [93] zu Contigs zusammengesetzt, wobei die k-mer-Länge zwischen 27 und 117 und ein Contig-Längenschwellenwert von 1000 bp variierte. Contigs wurden mit drei Programmen in Genom-Bins gruppiert: MaxBin2 v2.2.6 (94), MetaBAT v2.15.3 (95) und CONCOCT v1.1.0 (96), alle mit den Standardparametern. Die resultierenden Bins aus diesen drei Programmen wurden von DAS_Tool v1.1.4 [97] mit den Standardparametern derepliziert und aggregiert. Die Qualität der erhaltenen Genom-Bins wurde mit der Option „lineage_wf“ von CheckM v.1.1.3 bewertet [98]. Um die Qualität der der Brocadiales-Ordnung zugeordneten Genome zu verbessern, wurden die qualitätskontrollierten Lesevorgänge mithilfe von BBmap [92] auf die Contigs abgebildet und die kartierten Lesevorgänge wurden mithilfe von SPAdes v.3.14.0 [99] neu zusammengesetzt. Nach dem Entfernen von Contigs mit einer Länge von weniger als 1000 bp wurden die resultierenden Gerüste visualisiert und manuell mit gbtools [100] neu eingeteilt, wie in [13] beschrieben. Die Qualität des resultierenden Ca. Das Genom von Bathyanammoxibius wurde erneut mit dem CheckM-Befehl „lineage_wf“ überprüft, basierend auf dem Planctomycetes-Markergensatz.

Wir führten eine vergleichende Analyse der Genome Ca durch. Scalindua sediminis [13] und Ca. Bathyanammoxibius amoris (in dieser Studie entdeckt), die dominierende Art der beiden Anammox-Bakterienfamilien in Meeressedimenten [16]. Wir haben die Analyse mit Anvio v7.1 [101] gemäß dem unter http://merenlab.org/2016/11/08/pangenomics-v2/ beschriebenen Workflow durchgeführt. Alle Genome wurden zunächst mit Prokka v.1.14 (102) und BLASTp unter Verwendung der Clusters of Orthologous Groups of Proteins (COG) (103) als Referenzdatenbank annotiert. Die vergleichende Genomanalyse verwendet BLAST, um die Ähnlichkeit zwischen jedem Genpaar zu quantifizieren, und den Markov-Cluster-Algorithmus (MCL) [104] (mit einem Inflationsparameter von 2), um Cluster homologer Gene aufzulösen. Die gemeinsamen und einzigartigen Gene in den beiden Genomen wurden durch die funktionelle Anreicherungsanalyse identifiziert (105).

Ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit basierend auf 16 S-rRNA-Genen wurde für bekannte Anammox-Bakterien und nahe Verwandte der mutmaßlichen Anammox-OTUs rekonstruiert, die über BLASTn [106] in der NCBI-Datenbank identifiziert wurden. Die Sequenzen wurden mit MAFFT-LINSi (107) abgeglichen und der phylogenetische Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit wurde mit IQ-TREE v.1.5.5 (108) abgeleitet, wobei GTR + F + R5 das am besten geeignete Substitutionsmodell war, das von ModelFinder ausgewählt wurde (109). . Mit UFBoot2 [110] wurden 1000 ultraschnelle Bootstraps-Iterationen durchgeführt, um die Robustheit der Baumtopologie zu bewerten.

Für die Phylogenie von Amt (Ammoniumtransporter) wurden die Sequenzen von Anammox-Genomen aus der Prokka-Annotation extrahiert und als Abfrage in BLASTp [106]-Suchen in der NCBI-Datenbank verwendet (>50 % Ähnlichkeit blieben erhalten), um seine nahen Verwandten zu identifizieren . Diese Sequenzen wurden durch bekannte Nitrifizierer (z. B. Ammoniak-oxidierende Bakterien (AOB) aus den Gattungen Nitrosospira, Nitrosomonas, Nitrososcoccus, Nitrit-oxidierende Bakterien (NOB) aus Nitrospira und Nitrospina und Ammoniak-oxidierende Archaeen (AOA) aus dem Stamm der Thaumarchaeota ergänzt ) und mit MAFF-LINSi [107] ausgerichtet. Die Ausrichtung wurde mit trimAl [111] im Modus „Automatisiert“ getrimmt. Ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit wurde unter Verwendung von IQ-TREE v.1.5.5 [108] mit LG + F + R7 als am besten passendem Substitutionsmodell und 1.000 ultraschnellen Bootstraps rekonstruiert.

Alle in dieser Studie verwendeten Sequenzierungsdaten sind im NCBI Short Reads Archive unter der Projektnummer PRJNA854201 verfügbar. Rohe Metagenom-Sequenzierungsdaten des Kerns GS16-GC05 (55 cm) sind in der NCBI-Datenbank unter der BioSample-Nummer SUB11625283 verfügbar. Das Genom von Ca. Bathyanammoxibius amoris ist unter der Zugangsnummer JAMXCW000000000 erhältlich. Geochemische Rohdaten des Kerns GS14-GC04 finden Sie in den Zusatzdaten S1. Eine Zusammenstellung der Porenwasserprofile von Nitrat, Nitrit und Ammonium für die 28 in Abbildung S3 gezeigten Referenzstandorte finden Sie in den Zusatzdaten S2.

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Sedimentkernbohrungen im AMOR-Gebiet wurden durch den Chefwissenschaftler Rolf Birger Pedersen und die Besatzung von R/V GO Sars ermöglicht. Wir danken Anita-Elin Fedøy für die Amplikonvorbereitung, Michael Melcher und Steffen Lydvo für die Probenentnahme und DNA-Extraktion sowie Jan-Kristoffer Landro für die Messung des Kohlenstoff- und Stickstoffgehalts im Sediment. Konstruktive Kommentare anonymer Rezensenten haben die Qualität dieses Artikels erheblich verbessert. Diese Forschungsarbeit wurde vom norwegischen Forschungsrat über das Centre for Excellence in Geobiology, die KG Jebsen Foundation und die Trond Mohns Science Foundation an SLJ sowie die Simons Foundation Grant 622065 und die National Science Foundation Grants OCE-2138890 und OCE-2142998 an ARB finanziert . RZ wird durch das MIT Molina Postdoctoral Fellowship unterstützt.

Abteilung für Erd-, Atmosphären- und Planetenwissenschaften, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02139, USA

Rui Zhao & Andrew R. Babbin

Zentrum für Tiefseeforschung, Abteilung für Geowissenschaften, Universität Bergen, Bergen, 5007, Norwegen

Desiree L. Roerdink, Ingunn H. Thorseth und Steffen L. Jørgensen

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RZ und SLJ konzipierten die Studie. RZ, DR, IHT und SLJ sammelten Proben an Bord der Kreuzfahrten. DR und IHT führten die Porenwasserextraktion und -analyse durch. RZ, SLJ und ARB sammelten und analysierten die Genomdaten. Das RZ führte die DNA-Analysen durch und interpretierte die Ergebnisse. RZ und ARB haben das Manuskript geschrieben und alle Autoren haben es redigiert und genehmigt.

Korrespondenz mit Rui Zhao, Andrew R. Babbin oder Stephen L. Jørgensen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhao, R., Babbin, AR, Roerdink, DL et al. Nitritakkumulation und Anammox-Bakterien-Nischenaufteilung in Sedimenten des arktischen Mittelozeanischen Rückens. GEMEINSAMES ISME. 3, 26 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00230-y

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Eingegangen: 21. Februar 2023

Überarbeitet: 27. Februar 2023

Angenommen: 13. März 2023

Veröffentlicht: 29. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00230-y

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