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Nov 30, 2023

Malariamücken erfassen und scheiden Rinderurin aus, um die Lebensmerkmale zu verbessern

Malaria-Tagebuch

Malaria Journal Band 21, Artikelnummer: 180 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Aufnahme und Zuteilung von Nährstoffen integriert Nahrungssuche und lebensgeschichtliche Merkmale bei Insekten. Um den Mangel an einem bestimmten Nährstoff in verschiedenen Lebensstadien auszugleichen, können Insekten diese durch zusätzliche Fütterung, beispielsweise mit Wirbeltiersekreten, in einem Prozess, der als Pfützenbildung bezeichnet wird, ausgleichen. Die Mücke Anopheles arabiensis ist unterernährt und benötigt daher Nährstoffe sowohl für den Stoffwechsel als auch für die Fortpflanzung. Der Zweck dieser Studie bestand darin, zu beurteilen, ob An. arabiensis betreiben Pfützenbildung auf Rinderurin, um Nährstoffe zu erhalten und so die Lebensgeschichte zu verbessern.

Um festzustellen, ob An. arabiensis werden vom Geruch von frischem, 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden gealtertem Rinderurin angezogen. Wirtsuchende und mit Blut gefütterte Weibchen (48 Stunden nach der Blutmahlzeit) wurden in einem Y-Röhren-Olfaktometer untersucht und trächtige Weibchen beurteilt in einem Eiablagetest. Mithilfe kombinierter chemischer und elektrophysiologischer Analysen wurden anschließend die bioaktiven Verbindungen im Rinderurin aller vier Altersklassen identifiziert. Synthetische Mischungen bioaktiver Verbindungen wurden sowohl in Y-Röhren- als auch in Feldversuchen bewertet. Um den Rinderurin und seine wichtigste stickstoffhaltige Verbindung, Harnstoff, als potenzielle Ergänzungsnahrung für Malariaüberträger zu untersuchen, wurden Fütterungsparameter und Lebensverlaufsmerkmale gemessen. Bewertet wurden der Anteil weiblicher Mücken sowie die aufgenommene Menge an Rinderurin und -harnstoff. Nach der Fütterung wurden die Weibchen auf Überleben, Fesselflug und Fortpflanzung untersucht.

Wirtssuchender und blutgenährter An. arabiensis wurden sowohl in Labor- als auch in Feldstudien vom natürlichen und synthetischen Geruch von frischem und gealtertem Rinderurin angezogen. Trächtige Weibchen reagierten gleichgültig auf das Vorhandensein von Rinderurin an den Eiablagestellen. Wirtsuchende und mit Blut gefütterte Weibchen nahmen aktiv Urin und Harnstoff von Rindern auf und verteilten diese Ressourcen je nach lebensgeschichtlichen Kompromissen auf Flucht, Überleben oder Fortpflanzung als Funktion des physiologischen Zustands.

Anopheles arabiensis erwirbt und verteilt Rinderurin, um die Lebensgeschichte zu verbessern. Die zusätzliche Fütterung mit Rinderurin wirkt sich direkt auf die Vektorkapazität aus, indem sie das tägliche Überleben und die Vektordichte erhöht, sowie indirekt durch eine Veränderung der Flugaktivität und sollte daher in zukünftigen Modellen berücksichtigt werden.

Der Erwerb und die Zuteilung von Nährstoffen integrieren Nahrungssuche und lebensgeschichtliche Merkmale bei Insekten [1,2,3]. Insekten sind in der Lage, je nach Nahrungsverfügbarkeit und Nährstoffbedarf Nahrung auszuwählen und zu erwerben sowie eine kompensatorische Fütterung durchzuführen [1, 3]. Die Zuteilung von Nährstoffen hängt von lebensgeschichtlichen Prozessen ab und kann in verschiedenen Lebensstadien des Insekts zu unterschiedlichen Anforderungen an die Qualität und Quantität der Nahrung führen [1, 2]. Um den Mangel an einem bestimmten Nährstoff auszugleichen, können Insekten diese durch zusätzliche Nahrung aufnehmen, beispielsweise mit Schlamm, verschiedenen Exkrementen und Sekreten von Wirbeltieren und Aas, ein Prozess, der als Pfützenbildung bezeichnet wird [2]. Obwohl die Bildung von Pfützen hauptsächlich für verschiedene Schmetterlings- und Nachtfalterarten beschrieben wird, kommt sie auch bei anderen Insektenordnungen vor, bei denen die Anziehungskraft auf diese Arten von Ressourcen und deren Nahrungsaufnahme einen erheblichen Einfluss auf die Fitness und andere lebensgeschichtliche Merkmale hat [2, 4,5,6,7 ]. Die Malariamücke, Anopheles gambiae sensu lato (sl), schlüpft als „unterernährter“ Erwachsener [8], und Pfützenbildung mag daher eine wichtige Rolle für ihre lebensgeschichtlichen Merkmale spielen, ist aber ein Verhalten, das bisher beobachtet wurde übersehen. Die Einbeziehung der Pfützenbildung als Mittel zur Verbesserung der Nährstoffaufnahme in diesem wichtigen Vektor erfordert Aufmerksamkeit, da dies wichtige epidemiologische Konsequenzen haben kann.

Aufgrund geringer Kalorienreserven aus dem Larvenstadium und einer geringen Effizienz der Blutmehlverwertung [9] ist die Stickstoffaufnahme erwachsener weiblicher Malariamücken eingeschränkt. Weiblich An. Gambiae sl gleichen dies häufig durch die Einnahme zusätzlicher zusätzlicher Blutmahlzeiten aus [10, 11], wodurch mehr Menschen einem Krankheitsrisiko ausgesetzt werden und die Mücke einem erhöhten Raubrisiko ausgesetzt wird. Alternativ könnten Mücken die Nahrungsergänzung über die Ausscheidungen von Wirbeltieren nutzen, um stickstoffhaltige Verbindungen zu erhalten und so ihre Fitness und Flugmobilität zu verbessern, wie es für andere Insekten gezeigt wurde [2]. In dieser Hinsicht ist die starke und unterschiedliche Anziehungskraft einer der Geschwisterarten innerhalb der An. gambiae sl-Artenkomplex, Anopheles arabiensis, bis hin zu frischem und alterndem Rinderurin [12,13,14], ist faszinierend. Anopheles arabiensis bevorzugt opportunistische Wirte und ist dafür bekannt, dass sie sich mit Rindern verbindet und sich von ihnen ernährt. Rinderurin ist eine Ressource, die reich an stickstoffhaltigen Verbindungen ist, wobei Harnstoff 50–95 % des gesamten Stickstoffs im frischen Urin ausmacht [15, 16]. Mit zunehmendem Alter des Rinderurins nutzen Mikroben diese Ressourcen und reduzieren dadurch die Komplexität stickstoffhaltiger Verbindungen innerhalb von 24 Stunden [15]. Mit dem schnellen Anstieg des Ammoniaks, der mit dem Rückgang des organischen Stickstoffs einhergeht, gedeihen alkalophile Mikroben, von denen viele für Mücken giftige Verbindungen produzieren [15], was eine Hauptursache dafür sein könnte, warum weibliche An. arabiensis werden bevorzugt von Urin angezogen, der 24 Stunden oder weniger gealtert ist [13, 14].

In dieser Studie wurden wirtsuchende und mit Blut gefütterte An. arabiensis wurden innerhalb ihres ersten gonotrophen Zyklus daraufhin untersucht, ob sie durch Urinpfützen stickstoffhaltige Verbindungen, einschließlich Harnstoff, aufnehmen. Anschließend wurde eine Reihe von Experimenten durchgeführt, um festzustellen, wie weibliche Mücken diese potenzielle Nährstoffressource nutzen, um das Überleben, die Fortpflanzung und die weitere Nahrungssuche zu verbessern. Abschließend wurde der Geruch von frischem und gealtertem Rinderurin beurteilt, um festzustellen, ob dieser verlässliche Hinweise für Wirt suchende und mit Blut gefütterte Tiere liefert. arabiensis auf der Suche nach dieser potenziellen Nährstoffressource und die chemischen Korrelate, die der beobachteten unterschiedlichen Anziehung zugrunde liegen, wurden identifiziert. Die in 24 Stunden gealtertem Urin identifizierte synthetische Geruchsmischung aus flüchtigen organischen Verbindungen (VOCs) wurde unter Feldbedingungen weiter bewertet, wobei die unter Laborbedingungen erzielten Ergebnisse erweitert wurden und die Wirksamkeit des Geruchs von Rinderurin bei der Anlockung von Mücken unterschiedlicher physiologischer Zustände nachgewiesen wurde. Die erhaltenen Ergebnisse bestätigen, dass An. arabiensis erwerben und verteilen stickstoffhaltige Verbindungen im Urin von Wirbeltieren, um die Lebensgeschichte zu beeinflussen. Diese Ergebnisse werden im Zusammenhang mit möglichen epidemiologischen Konsequenzen und der Frage diskutiert, wie diese zur Vektorüberwachung und -kontrolle genutzt werden können.

Anopheles arabiensis (Dongola-Stamm) wurde bei 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relativer Luftfeuchtigkeit und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12:12 Stunden gehalten. Die Larven wurden in Plastikschalen (20 cm × 18 cm × 7 cm) aufgezogen, mit destilliertem Wasser gefüllt und mit Tetramin®-Fischfutter (Tetra Werke, Melle, DE) gefüttert. Puppen wurden in 30-ml-Bechern (Nolato Hertila, Åstorp, SE) gesammelt und in Bugdorm-Käfige (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science, Taichung, TW) überführt, damit die Erwachsenen schlüpfen konnten. Erwachsene wurden bis 4 Tage nach dem Auflaufen (dpe) ad libitum mit 10 %iger Saccharoselösung versorgt. Zu diesem Zeitpunkt wurden wirtsuchende Weibchen entweder sofort mit der Nahrung versorgt oder vor den Experimenten über Nacht mit Zugang zu destilliertem Wasser ausgehungert, wie beschrieben unten. Die für die Flugröhrenexperimente verwendeten Weibchen wurden nur 4–6 Stunden lang ausgehungert und hatten nach Belieben Zugang zu Wasser. Um mit Blut gefütterte Mücken auf nachfolgende Bioassays vorzubereiten, wurde 4 dpe-Weibchen defibriniertes Schafsblut (Håtunalab, Bro, SE) unter Verwendung eines Membranfütterungssystems (Hemotek Discovery Workshops, Accrington, UK) verabreicht. Vollständig vollgestopfte Weibchen wurden anschließend in separate Käfige überführt und erhielten vor den unten beschriebenen Experimenten entweder direkt eine Diät, wie unten beschrieben, oder ad libitum Zugang zu 10 % Saccharose für 3 Tage. Die letztgenannten Weibchen wurden für die Flugröhren-Bioassays verwendet und in den Versuchsraum überführt und dann 4–6 Stunden vor den Experimenten mit ad libitum-Zugang zu destilliertem Wasser ausgehungert.

Fütterungstests wurden verwendet, um den Verbrauch von Urin und Harnstoff durch erwachsene An zu quantifizieren. arabiensis-Weibchen. Wirtsuchende und mit Blut gefütterte Weibchen erhielten 48 Stunden lang Futter, das eine 1 %ige Verdünnung von frischem und gealtertem Rinderurin, verschiedene Harnstoffkonzentrationen sowie zwei Kontrollen, 10 % Saccharose und Wasser, enthielt. Zusätzlich wurde der Nahrung ein Lebensmittelfarbstoff (1 mg ml−1 Xylolcyanol FF; CAS 2650-17-1; Sigma-Aldrich, Stockholm, SE) zugesetzt und in einer 4 × 4-Matrix aus 250 µl Mikrozentrifugenröhrchen bereitgestellt (Axygen Scientific, Union City, CA, USA; Abb. 1A) bis zum Rand gefüllt (ca. 300 µl). Um die Konkurrenz zwischen Mücken und den möglichen Einfluss der Farbe des Farbstoffs zu vermeiden, wurden zehn Mücken in großen Petrischalen (12 cm Durchmesser, 6 cm Höhe; Semadeni, Ostermundigen, CH; Abb. 1A) in völliger Dunkelheit bei 25 ± 2 platziert °C und 65 ± 5 % relative Luftfeuchtigkeit. Diese Experimente wurden fünf- bis zehnmal wiederholt. Nach der Exposition gegenüber der Nahrung wurden die Mücken bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gehalten.

Urin und Harnstoff von Rindern, aufgenommen von weiblichen Anopheles arabiensis, die auf Wirtssuche sind und sich mit Blut ernähren. Weibliche Mücken wurden in einem Fütterungstest mit einer Nahrung versorgt, die aus frischem und gealtertem Rinderurin, verschiedenen Konzentrationen an Harnstoff, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O) bestand (A). Wirtsuchende (B) und mit Blut gefütterte (C) Weibchen nahmen größere Mengen Saccharose auf als alle anderen getesteten Diäten. Beachten Sie, dass wirtsuchende Weibchen weniger 72 Stunden alten Rinderurin tranken als 168 Stunden alten Rinderurin (B). Der durchschnittliche Gesamtstickstoffgehalt des Urins (± Standardabweichung) ist im Einschub dargestellt. Harnstoff wurde dosisabhängig von wirtsuchenden (D, F) und bluternährten (E, G) Weibchen aufgenommen. Das mittlere aufgenommene Volumen (D, E) mit unterschiedlichen Buchstabenbezeichnungen unterscheidet sich signifikant voneinander (einseitige Varianzanalyse mit einer Tukey-Post-hoc-Analyse; p < 0,05). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar (B–E). Die geraden gepunkteten Linien stellen die logarithmisch-linearen Regressionslinien (F, G) dar.

Um die aufgenommene Nahrung freizusetzen, wurden die Mücken einzeln in 1,5-ml-Mikrofugenröhrchen mit 230 µl destilliertem Wasser gegeben und die Gewebe mit einem Einwegstößel und einem Akkumotor (VWR International, Lund, SE) aufgeschlossen und dann 10 Minuten lang bei 10 krpm zentrifugiert Mindest. Die Überstände (200 µl) wurden in eine 96-Well-Mikroplatte (Sigma-Aldrich) überführt und die Absorption (λ620 nm) mit einem spektrophotometerbasierten Mikroplattenlesegerät (SPECTROStar® Nano, BMG Labtech, Ortenberg, DE) bestimmt. Alternativ wurden die Mücken in 1 ml destilliertem Wasser gemahlen, von dem 900 µl zur spektrophotometrischen Analyse in eine Küvette überführt wurden (λ620 nm; UV 1800, Shimadzu, Kista, SE). Um die aufgenommene Nahrung zu quantifizieren, wurde eine Standardkurve durch eine Reihenverdünnung erstellt, die einen Bereich von 0,2 µl bis 2,4 µl von 1 mg ml-1 Xylolcyanol ergab. Anschließend wurde die optische Dichte bekannter Farbstoffkonzentrationen verwendet, um das von jeder Mücke aufgenommene Nahrungsvolumen zu bestimmen.

Die volumetrischen Daten wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von einem paarweisen Tukey-Post-hoc-Vergleich (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA, 1989–2007). Die lineare Regressionsanalyse beschrieb die konzentrationsabhängige Harnstoffaufnahme und es wurden Vergleiche zwischen den Reaktionen von wirtsuchenden und bluternährten Mücken durchgeführt (GraphPad Prism v8.0.0 für Mac, GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Ungefähr 20 µl Probenurin aus jeder Alterskategorie wurden auf Chromosorb® W/AW (10 mg 80/100 Mesh, Sigma Aldrich) gebunden und in Zinnkapseln (8 mm × 5 mm) eingeschlossen. Die Kapsel wurde in eine Brennkammer eines CHNS/O-Analysators (Flash 2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) eingeführt, um den Stickstoffgehalt von frischem und gealtertem Urin gemäß dem Protokoll des Herstellers zu bestimmen. Der Gesamtstickstoff (g N l−1) wurde anhand bekannter Harnstoffkonzentrationen, die als Standard verwendet wurden, quantifiziert.

Um den Einfluss der Ernährung auf das Überleben wirtsuchender und mit Blut gefütterter Weibchen zu beurteilen, wurden Mücken einzeln in große Petrischalen (Durchmesser 12 cm, Höhe 6 cm; Semadeni) mit einem mit einem Netz bedeckten Loch im Deckel (3 cm) gegeben Durchmesser) zur Belüftung und Ernährungsversorgung. Die Futtermittel, bestehend aus einer 1 %igen Verdünnung von frischem und gealtertem Rinderurin, vier Harnstoffkonzentrationen sowie zwei Kontrollen, 10 % Saccharose und Wasser, wurden direkt nach 4 Tagen verabreicht. Jede Diät wurde auf zahnärztliche Watterollen (DAB Dental AB, Upplands Väsby, SE) pipettiert, in 5-ml-Spritzen (Thermo Fisher Scientific, Göteborg, SE) eingeführt, der Kolben entfernt und dann auf die Petrischalen gelegt (Abb. 1A). Die Diäten wurden täglich ausgetauscht. Der Versuchsraum wurde wie oben beschrieben gepflegt. Überlebende Mücken wurden zweimal täglich gezählt, während tote Mücken verworfen wurden, bis die letzte Mücke starb (n = 40 pro Behandlung). Das Überleben der Mücken, die sich von den jeweiligen Diäten ernährten, wurde mithilfe von Kaplan-Meyer-Überlebenskurven und Log-Rank-Teststatistiken zum Vergleich der Überlebensverteilung zwischen Diäten analysiert (IBM SPSS Statistics 24.0.0.0).

Eine maßgeschneiderte Mückenflugmühle, basierend auf Attisano et al. [17] wurde aus 5 mm dicken, klaren Acrylplatten (10 cm B × 10 cm L × 10 cm H) ohne Vorder- und Rückseite hergestellt (Abb. 3: oben). Eine Drehanordnung mit einem vertikalen Rohr aus einer Gaschromatographiesäule (0,25 mm Innendurchmesser; 7,5 cm L), das an beiden Enden mit Insektenstiften verklebt war, wurde zwischen einem Paar Neodym-Magneten im Abstand von 9 cm aufgehängt. Ein horizontales Rohr aus dem gleichen Material (6,5 cm L) teilte das vertikale Rohr und bildete einen Haltearm und einen Arm, der ein kleines Stück Aluminiumfolie als Fotounterbrechungssignal trug.

Vor dem Anbinden erhielten 24 Stunden lang ausgehungerte Weibchen 30 Minuten lang Zugang zu den oben beschriebenen Diäten. Vollständig genährte weibliche Mücken wurden dann einzeln für 2–3 Minuten auf Eis betäubt und mit Bienenwachs auf einen Insektenstift (Joel Svenssons Vaxfabrik AB, Munka Ljungby, SE) an ihrem Mesothorax geklebt und dann am Arm des horizontalen Rohrs befestigt die Flugmühle. Jede Flugumdrehung wurde von einem maßgeschneiderten Datenlogger protokolliert, dann mit der Software PC-Lab 2000™ (v4.01; Velleman, Gavere, BE) gespeichert und angezeigt. Die Flugmühle wurde in einen klimatisierten Raum gestellt (12 h: 12 h, hell: dunkel, 25 ± 2 °C, 65 ± 5 % relative Luftfeuchtigkeit).

Um das Muster der Flugaktivität zu visualisieren, wurden die gesamte geflogene Distanz (m) und die Gesamtzahl der Anfälle kontinuierlicher Flugaktivität stündlich über einen Zeitraum von 24 Stunden berechnet. Darüber hinaus wurde die durchschnittliche geflogene Distanz einer einzelnen Frau zwischen den verschiedenen Behandlungen verglichen und mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse gefolgt von einer Tukey-Post-hoc-Analyse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) analysiert Die durchschnittliche Entfernung wurde als abhängige Variable betrachtet, während die Behandlungen die unabhängigen Faktoren waren. Darüber hinaus wurde die durchschnittliche Anzahl der Kämpfe in 10-Minuten-Schritten berechnet.

Um die Auswirkung der Ernährung auf die Fortpflanzungsleistung von An zu beurteilen. arabiensis, sechs Weibchen (4 dpe) wurden direkt nach der Blutfütterung in Bugdorm-Käfige (30 cm × 30 cm × 30 cm) überführt und dann 48 Stunden lang mit experimenteller Nahrung, wie oben beschrieben, versorgt. Anschließend wurden die Futtermittel entfernt und am dritten Tag Eiablagebecher (30 ml; Nolato Hertila), gefüllt mit 20 ml destilliertem Wasser, bereitgestellt und 48 Stunden lang zur Verfügung gestellt, wobei die Becher alle 24 Stunden ausgetauscht wurden. Jede Diät wurde 20–50 Mal wiederholt. Die Eier wurden für jeden Versuchskäfig gezählt und aufgezeichnet. Eine Unterprobe von Eiern wurde verwendet, um die durchschnittliche Größe und Variation zwischen den Längen einzelner Eier (n ≥ 200 pro Diät) mithilfe eines Dialux-20-Mikroskops (DM1000; Ernst Leitz Wetzlar, Wetzlar, DE) zu bestimmen, das mit einer Leica-Kamera (DFC) ausgestattet war 320 R2; Leica Microsystem Ltd, DE). Die verbleibenden Eier wurden 24 Stunden lang in einer klimatisierten Kammer unter Standardaufzuchtbedingungen gehalten und eine Teilprobe kürzlich geschlüpfter Larven im ersten Stadium (n ≥ 200 pro Nahrung) wurde wie oben gemessen. Die Anzahl der Eier sowie die Größe von Eiern und Larven wurden zwischen den verschiedenen Behandlungen verglichen und mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse gefolgt von einer Tukey-Post-hoc-Analyse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) analysiert .).

Flüchtige Headspace-Inhaltsstoffe aus frischem (1 Stunde nach der Probenahme), 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden gealtertem Urin wurden aus Proben von Zebu-Rindern der Arsi-Rasse gesammelt. Aus Bequemlichkeits- und Verfügbarkeitsgründen wurden die Urinprobenentnahmen frühmorgens durchgeführt, während sich die Rinder noch im Stall befanden. Von zehn Personen wurden Urinproben entnommen, wobei 100–200 ml jeder Probe in separate Polyamid-Röstbeutel (Toppits Cofresco, Frischhalteprodukte GmbH und Co., Minden, DE) überführt wurden, die in einem 3-l-Polyvinylchlorid-Kunststoffeimer mit Deckel platziert waren. Die flüchtigen Bestandteile im Kopfraum jeder einzelnen Rinderurinprobe wurden entweder direkt (frisch) oder nach einer Reifung für 24, 72 und 168 Stunden bei Raumtemperatur gesammelt, dh jede Urinprobe war in jeder Altersgruppe vertreten.

Für die Sammlung flüchtiger Stoffe im Kopfraum wurde ein geschlossenes Kreislaufsystem verwendet, bei dem ein mit Aktivkohle gefilterter Luftstrom (100 ml min−1) mithilfe einer Membranvakuumpumpe (KNF Neuberger, Freiburg, DE) durch den Polyamidbeutel auf eine Adsorptionsmittelsäule zirkuliert wurde. , für 2,5 Stunden. Als Kontrolle wurde eine Headspace-Sammlung aus einem leeren Polyamidbeutel durchgeführt. Die Adsorptionssäule bestand aus Teflonrohren (5,5 cm × 3 mm Innendurchmesser), die 35 mg Porapak Q (50/80 Mesh; Waters Associates, Milford, MA, USA) zwischen Glaswollstopfen enthielten. Die Säulen wurden vor der Verwendung mit 1 ml erneut destilliertem n-Hexan (Merck, Darmstadt, DE) und 1 ml Pentan (99,0 % reines Lösungsmittel, GC-Qualität, Sigma Aldrich) gespült. Adsorbierte flüchtige Bestandteile wurden mit 400 μl Pentan eluiert. Headspace-Sammlungen wurden gepoolt und dann bei –20 °C gelagert, bis sie für weitere Analysen verwendet wurden.

Verhaltensreaktionen von wirtsuchenden und bluternährten An. arabiensis-Mücken zum Kopfraum flüchtiger Extrakte, die aus frischem, 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden gealtertem Urin gesammelt wurden, wurden mit einem geraden Glasröhrchen-Olfaktometer analysiert [18]. Die Experimente wurden während der höchsten Wirtssuchaktivitätsperiode, ZT 13–15, von An durchgeführt. arabiensis [19]. Das Glasröhren-Olfaktometer (80 cm × 9,5 cm Innendurchmesser) wurde mit rotem Licht von oben bei 3 ± 1 lx beleuchtet. Ein mit Aktivkohle gefilterter und befeuchteter Luftstrom (25 ± 2 °C, 65 ± 2 % relative Luftfeuchtigkeit) strömte mit 30 cm s−1 durch den Bioassay. Die Luft strömte durch eine Reihe von Maschensieben aus rostfreiem Stahl, um eine laminare Strömung und eine homogene Fahnenstruktur zu erzeugen. Es wurden zahnärztliche Watterollenspender (4 cm × 1 cm; L:D; DAB Dental AB) verwendet, die an einer 5 cm langen Drahtspule am windzugewandten Ende des Olfaktometers aufgehängt waren, und der Stimulus wurde alle 5 Minuten ausgetauscht. Für die Analyse wurden 10 μl jedes Headspace-Extrakts in einer Verdünnung von 1:10 als Stimulus verwendet. Als Kontrolle wurde eine äquivalente Menge Pentan verwendet. Einzelne wirtssuchende oder mit Blut gefütterte Mücken wurden 2–3 Stunden vor Beginn der Experimente in separate Freilassungskäfige gesetzt. Der Freisetzungskäfig wurde am windabgewandten Ende des Olfaktometers platziert und den Mücken wurde eine Minute Zeit gegeben, sich zu akklimatisieren, bevor die Absperrklappe des Käfigs für ihre Freisetzung geöffnet wurde. Die Anziehungskraft auf Behandlung oder Kontrolle wurde als Anteil der Mücken analysiert, die innerhalb von 5 Minuten nach der Freisetzung Kontakt mit der Quelle hatten. Jeder flüchtige Headspace-Extrakt und jede Kontrolle wurde mindestens 30 Mal wiederholt, und um Tageseffekte zu vermeiden, wurde an jedem Versuchstag die gleiche Anzahl von Behandlungen und Kontrollen getestet. Reaktionen des wirtsuchenden und blutgenährten An. arabiensis zu den Headspace-Sammlungen wurden mithilfe einer nominalen logistischen Regression analysiert, gefolgt von paarweisen Vergleichen der Odds-Verhältnisse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).

Die Eiablagereaktion von An. arabiensis zu den Headspace-Extrakten von frischem und gealtertem Rinderurin wurde in Bugdorm-Käfigen (30 cm × 30 cm × 30 cm; MegaView Science) analysiert. Plastikbecher (30 ml; Nolato Hertila), gefüllt mit 20 ml destilliertem Wasser, stellten das Eiablagesubstrat bereit und wurden in gegenüberliegenden Ecken des Käfigs im Abstand von 24 cm platziert. Der Behandlungsbecher wurde mit 10 μl jedes Headspace-Extrakts in einer Verdünnung von 1:10 konditioniert. Zur Konditionierung des Kontrollbechers wurde eine äquivalente Menge Pentan verwendet. Zwischen jedem Experiment wurden Behandlungs- und Kontrollbecher ausgetauscht, um Standorteffekte zu kontrollieren. Zehn mit Blut gefütterte Weibchen wurden bei ZT 9–11 in die Versuchskäfige entlassen und die Anzahl der Eier in den Bechern wurde nach 24 Stunden gezählt. Ein Eiablageindex wurde wie folgt berechnet: (Anzahl der in Behandlungsbecher gelegten Eier – Anzahl der in den Kontrollbechern gelegten Eier)/(Gesamtzahl der Eier). Jede Behandlung wurde achtmal wiederholt.

Kombinierte Gaschromatographie- und Elektroantennographie-Detektionsanalysen (GC-EAD) von weiblichen An. arabiensis wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt [20]. Kurz gesagt wurde ein Agilent Technologies 6890 GC (Santa Clara, CA, USA), ausgestattet mit einer HP-5-Säule (30 m × 0,25 mm ID, 0,25 μm Filmdicke, Agilent Technologies), verwendet, um die flüchtigen Extrakte im Kopfraum von frischen Extrakten zu trennen und gealterter Urin. Als mobile Phase wurde Wasserstoff mit einer durchschnittlichen linearen Flussrate von 45 cm s−1 verwendet. Jede Probe (2 μl) wurde im Splitless-Modus 30 s lang bei einer Injektortemperatur von 225 °C injiziert. Die GC-Ofentemperatur wurde von 35 °C (3 Min. Haltezeit) bei 10 °C min−1 bis 300 °C (10 Min. Haltezeit) programmiert. Am GC-Abflussverteiler wurden 4 psi Stickstoff zugegeben und 1:1 in einem Gerstel 3D/2 Vierwegekreuz mit geringem Totvolumen (Gerstel, Mülheim, DE) zwischen dem Flammenionisationsdetektor und dem EAD aufgeteilt. Die GC-Abflusskapillare für das EAD gelangte über eine Gerstel ODP-2-Transferleitung, die der GC-Ofentemperatur plus 5 °C folgte, in ein Glasrohr (10 cm × 8 mm), wo es mit kohlegefiltertem, befeuchtetem Wasser vermischt wurde Luft (1,5 l min−1). Die Antenne wurde 0,5 cm vom Auslass dieses Rohrs entfernt platziert. Jede einzelne Mücke stellte eine einzige Wiederholung dar, und für wirtssuchende Mücken wurden für jedes Alter der Urinproben mindestens drei Wiederholungen durchgeführt.

Bioaktive Verbindungen in den Headspace-Sammlungen von frischem und gealtertem Rinderurin, die in den GC-EAD-Analysen eine Antennenreaktion hervorrufen, wurden mithilfe eines kombinierten GC- und Massenspektrometers (GC-MS; 6890 GC und 5975 MS; Agilent Technologies) identifiziert im Elektronenstoßionisationsmodus bei 70 eV. Der GC war mit einer HP-5MS UI-beschichteten Quarzglas-Kapillarsäule (60 m × 0,25 mm Innendurchmesser, 0,25 μm Filmdicke) ausgestattet und Helium wurde als mobile Phase mit einer durchschnittlichen linearen Flussrate von 35 cm s−1 verwendet. Eine 2-μl-Probe wurde mit den gleichen Injektoreinstellungen und Ofentemperaturen wie für die GC-EAD-Analyse injiziert. Die Verbindungen wurden anhand ihrer Retentionszeiten (Kovát-Indizes) und Massenspektren im Vergleich mit maßgeschneiderten und NIST14-Bibliotheken (Agilent) identifiziert. Identifizierte Verbindungen wurden durch Injektion authentischer Standards bestätigt (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Zur Quantifizierung wurde Heptylacetat (10 ng, 99,8 % chemische Reinheit, Aldrich) als externer Standard injiziert.

Um die Wirksamkeit der synthetischen Geruchsmischungen zu beurteilen, die aus den in frischem und gealtertem Urin identifizierten bioaktiven Verbindungen bestehen, um Wirtssuchende und blutgenährte An anzulocken. arabiensis wurden das gleiche Olfaktometer und Protokoll wie oben beschrieben verwendet. Die synthetischen Mischungen ahmten die Zusammensetzung und das Verhältnis der Verbindungen in den gepoolten flüchtigen Headspace-Extrakten von frischem, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden gealtertem Urin nach (Abb. 5D – G; Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Für die Analyse wurden 10 μl einer 1:100-Verdünnung der vollsynthetischen Mischungen mit Gesamtfreisetzungsraten im Bereich von etwa 140–2400 ng h−1 verwendet, um die Anziehungskraft von wirtssuchenden und blutgenährten Mücken zu beurteilen. Anschließend wurden subtraktive Mischungen, bei denen einzelne Verbindungen der Gesamtmischung entfernt wurden, mit der Gesamtmischung verglichen. Reaktionen des wirtsuchenden und blutgenährten An. arabiensis zu den synthetischen und subtraktiven Mischungen wurden mithilfe einer nominalen logistischen Regression analysiert, gefolgt von paarweisen Vergleichen der Odds-Verhältnisse (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.).

Um zu beurteilen, ob Rinderurin als Wirtslebensraum-Hinweis für Malariamücken dient, wurden frischer und gealterter Rinderurin, der wie oben gesammelt wurde, sowie Wasser in mit einem Netz bedeckte 3-l-Eimer (100 ml) mit seitlichen Perforationen gegeben und aufgestellt auf Wirts-Köderfallen (BG-HDT-Version; BioGents, Regensburg, DE). Die zehn Fallen wurden im Abstand von 50 m auf einer Weide aufgestellt, die 400 m von einer Dorfgemeinschaft (Sile, Äthiopien, 5°53´24´´N, 37°29´24´´E) entfernt und ohne Vieh dazwischen lag die ständige Brutstätte und das Dorf. Fünf Fallen wurden erhitzt, um die Anwesenheit eines Wirts zu simulieren, während fünf Fallen unbeheizt blieben. Die Position jeder Behandlung wurde insgesamt fünf Nächte lang jede Nacht gewechselt. Vergleiche zwischen der Anzahl der Mücken, die in Fallen gefangen wurden, die mit Urin unterschiedlichen Alters beködert wurden, wurden mithilfe einer logistischen Regression mit einer Beta-Binomialverteilung (JMP Pro, v14.0.0, SAS Institute Inc.) durchgeführt.

Die Wirksamkeit der synthetischen 24-Stunden-Rinderurin-Geruchsmischung zur Anlockung wilder Mücken auf dem Feld wurde in einem von Malaria endemischen Dorf in der Nähe der Stadt Meki in der Region Oromia in Äthiopien (8° 11′ 08″ N, 38° 81′) bewertet. 70″ E; Abb. 6A). Die Studie wurde zwischen Mitte August und Mitte September vor der jährlichen Restbesprühung in Innenräumen in Verbindung mit der langen Regenzeit durchgeführt. Für die Studie wurden fünf Häuserpaare (20–50 m voneinander entfernt) am Rande des Dorfes ausgewählt (Abb. 6A). Kriterien für die Auswahl der Häuser waren: In den Häusern durften keine Tiere gehalten werden, in den Häusern durfte (zumindest während des Versuchszeitraums) nicht gekocht (Räuchern von Brennholz oder Holzkohle) und in Häusern mit maximal zwei Bewohnern geschlafen werden unter nicht mit Insektiziden behandelten Moskitonetzen. Die ethische Genehmigung wurde vom Institutional Research Ethics Review Board, College of Natural Sciences (CNS-IRB) der Universität Addis Abeba (IRB/022/2016) gemäß den Richtlinien der World Medical Association Declaration of Helsinki eingeholt. Mit Unterstützung von Gesundheitsberatern wurde die Zustimmung jedes Haushaltsvorstands eingeholt. Der gesamte Prozess wurde von der lokalen Verwaltung auf Bezirks- und Gemeindeebene („Kebele“) befürwortet. Das Versuchsdesign folgte einem 2 × 2-Latin-Square-Design, bei dem die synthetische Mischung und die Kontrolle in der ersten Nacht gepaarten Häusern zugewiesen und in der nächsten Versuchsnacht zwischen den Häusern ausgetauscht wurden. Dieses Verfahren wurde zehnmal wiederholt. Um die Aktivität der Mücken in den ausgewählten Häusern abzuschätzen, wurden außerdem CDC-Fallen ohne Spender für synthetische Mischungen fünf Nächte lang zu denselben Tageszeiten zu Beginn, in der Mitte und am Ende der Feldversuche in Betrieb gesetzt.

Die synthetische Mischung, die die sechs bioaktiven Verbindungen in ihrem natürlichen Verhältnis (7:9:156:156:1:4; Abb. 5D–G; Zusatzdatei 1: Tabelle S2) enthielt, wurde in Heptan (97,0 % Lösungsmittel GC-Qualität, Sigma Aldrich) und mit Baumwolldochtspendern bei 140 ng h−1 freigesetzt [20]. Die Dochtspender ermöglichen die Freisetzung aller Verbindungen in konstanten Anteilen während des 12-stündigen Experiments. Als Kontrolle wurde Heptan verwendet. Die Fläschchen wurden neben dem Eingangspunkt einer Lichtfalle des Center for Disease Control and Prevention (CDC) (John W. Hock Company, Gainesville, FL, USA; Abb. 6A) aufgehängt. Die Fallen wurden 0,8 – 1 m über dem Boden neben der Fußseite eines Bettes aufgehängt, während ein Freiwilliger unter einem unbehandelten Moskitonetz schlief, und zwischen 18:00 und 06:30 Uhr in Betrieb genommen. Die gefangenen Mücken wurden nach Geschlecht und physiologischem Zustand sortiert (ungefüttert, gefüttert, halbträchtig und trächtig [21]). Anschließend wurden die Mücken morphologisch nach Arten identifiziert [9, 22] und in 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit trockenem Kieselgel gegeben. Fünf Prozent der Mücken, die morphologisch als An. gambiae sl identifiziert wurden, wurden anschließend mithilfe einer Polymerasekettenreaktionsanalyse (PCR) gescreent, um das Mitglied des Artenkomplexes zu identifizieren [23]. Um die Wirkung der Behandlung auf die der Kontrolle in der zu beurteilen In Feldstudien wurden Fallenfänge der gepaarten Häuser mithilfe eines nominalen logistischen Anpassungsmodells analysiert, bei dem die Anziehung die abhängige Variable und die Behandlung (synthetische Mischung vs. Kontrolle) der feste Effekt war (JMP® 14.0.0. SAS Institute Inc.). Hier geben wir den χ2- und p-Wert aus dem Likelihood-Ratio-Test an.

Um zu beurteilen, ob An. arabiensis sind in der Lage, Urin und seine Hauptquelle für Stickstoff, Harnstoff, durch direkte Fütterung zu gewinnen. 4 Tage nach dem Auflaufen (dpe) suchende und mit Blut gefütterte Weibchen erhielten über einen Zeitraum von 48 Stunden Zugang zu dieser Nahrung ein Fütterungstest (Abb. 1A). Sowohl wirtsuchende als auch mit Blut gefütterte Weibchen nahmen signifikant größere Mengen Saccharose auf als alle anderen Diäten oder Wasser (F(5.426) = 20,15, p < 0,0001 bzw. F(5.299) = 56,00, p < 0,0001; Abb. 1B, C). Darüber hinaus ernährten sich wirtsuchende Weibchen weniger mit 72 Stunden altem Urin als mit 168 Stunden altem Urin (Abb. 1B). Bei der Versorgung mit harnstoffhaltiger Nahrung nahmen wirtsuchende Weibchen im Vergleich zu allen anderen Konzentrationen und Wasser ein deutlich größeres Volumen von 2,69 mM Harnstoff auf, ohne sich von 10 % Saccharose zu unterscheiden (F(10,813) = 15,72, p < 0,0001; Abb. 1D). ). Dies unterschied sich von der Reaktion bluternährter Weibchen, die im Allgemeinen deutlich größere Mengen an harnstoffhaltiger Nahrung im Vergleich zu Wasser zu sich nahmen, obwohl sie im Vergleich zu 10 % Saccharose deutlich kleinere Mengen zu sich nahmen (F(10.557) = 78,35, p < 0,0001; Abb. 1E). Darüber hinaus nahmen beim Vergleich der beiden physiologischen Zustände mit Blut gefütterte Weibchen bei der niedrigsten Konzentration mehr Harnstoff auf als ihre wirtsuchenden Artgenossen, während diese Weibchen bei höheren Konzentrationen ähnliche Mengen aufnahmen (F(1.953) = 78,82, p < 0,0001; Abb . 1F, G). Während die Aufnahmemenge der harnstoffhaltigen Nahrung ein Optimum zu haben schien (Abb. 1D, E), waren Weibchen beider physiologischer Zustände in der Lage, die aufgenommene Harnstoffmenge über den gesamten Bereich der Harnstoffkonzentrationen logarithmisch linear zu regulieren Mode (Abb. 1F, G). In ähnlicher Weise scheinen Mücken ihre Stickstoffaufnahme zu kontrollieren, indem sie das Volumen des aufgenommenen Urins regulieren, da sich die Stickstoffmenge im Urin im aufgenommenen Volumen widerspiegelt (Abb. 1B, Einschub C und B).

Um die Rolle von Urin und Harnstoff für das Überleben wirtsuchender und bluternährter Mücken zu beurteilen, wurden Weibchen mit Urin aller vier Altersstufen (frisch, 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden nach der Abscheidung) und einer Reihe von Harnstoffen gefüttert Konzentrationen sowie destilliertes Wasser und 10 % Saccharose als Kontrollen (Abb. 2A). Diese Überlebensanalyse ergab, dass die Ernährung einen signifikanten Einfluss auf die Gesamtüberlebensrate wirtsuchender Weibchen hatte (Urin: χ2 = 108,5, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ2 = 122,8, df = 5, p < 0,0001; Abb . 2B, C) und bluternährten Weibchen (Urin: χ2 = 93,0, df = 5, p < 0,0001; Harnstoff: χ2 = 137,9, df = 5, p < 0,0001; Abb. 2D, E). In allen Experimenten hatten Weibchen, die sich mit Urin, Harnstoff und Wasser ernährten, eine deutlich geringere Überlebensrate im Vergleich zu Weibchen, die Saccharose als Nahrung erhielten (Abb. 2B–E). Wirtsuchende Weibchen, die sich von frischem und gealtertem Urin ernährten, zeigten unterschiedliche Überlebenschancen, wobei diejenigen, die sich von 72 Stunden gealtertem Urin ernährten (p = 0,016), die geringste Überlebenswahrscheinlichkeit hatten (Abb. 2B). Darüber hinaus überlebten wirtsuchende Weibchen, die mit 135 mM Harnstoff gefüttert wurden, länger als mit der Wasserkontrolle (p < 0,04) (Abb. 2C). Mit Blut gefütterte Weibchen überlebten länger, wenn sie mit frischem und 24 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden, verglichen mit Wasser (p = 0,001 bzw. p = 0,012; Abb. 2D), während Weibchen, die mit 72 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden, kürzer überlebten als diejenigen, die mit Wasser gefüttert wurden auf frischem und 24 Stunden gealtertem Urin (p < 0,0001 bzw. p = 0,013; Abb. 2D). Bei der Fütterung mit 135 mM Harnstoff überlebten mit Blut gefütterte Weibchen länger als alle anderen Harnstoff- und Wasserkonzentrationen (p < 0,013; Abb. 2E).

Überleben von wirtsuchenden und bluternährten weiblichen Anopheles arabiensis, die sich mit Rinderurin und Harnstoff ernährten. Weibliche Mücken wurden in einem Bioassay mit einer Nahrung versorgt, die aus frischem und gealtertem Rinderurin, verschiedenen Konzentrationen an Harnstoff, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O) bestand (A). Das Überleben einzelner wirtssuchender (B, C) und bluternährter (D, E) Mücken wurde alle 12 Stunden aufgezeichnet, bis sich alle Weibchen von Urin (B, D) und Harnstoff (C, E) ernährten die Kontrollen, Saccharose und Wasser, waren abgestorben

Die Gesamtentfernung und Anzahl der Anfälle, die in einem Flugmühlentest über einen Zeitraum von 24 Stunden ermittelt wurden, unterschieden sich zwischen wirtssuchenden und bluternährten Mücken, wobei bluternährte Mücken insgesamt eine geringere Flugaktivität zeigten (Abb. 3). Wirtssuchende Mücken, die mit frischem und gealtertem Urin oder mit Saccharose und Wasser versorgt wurden, zeigten unterschiedliche Flugmuster (Abb. 3), wobei Weibchen, die mit frischem Urin gefüttert wurden, im Morgengrauen aktiver waren, während diejenigen, die mit 24 Stunden und 168 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden, dies zeigten überwiegend tagsüber Aktivität. Weibliche Mücken, die entweder mit Saccharose oder 72 Stunden gealtertem Urin versorgt wurden, zeigten über den gesamten 24-Stunden-Zeitraum Aktivität, während diejenigen, die mit Wasser versorgt wurden, in der mittleren Skotophase aktiver waren. Mit Saccharose gefütterte Mücken zeigten die höchsten Aktivitätswerte in der späten Nacht und am frühen Morgen, während diejenigen, die 72 Stunden gealterten Urin tranken, ihre Aktivität über die 24 Stunden hinweg stetig verringerten (Abb. 3).

Flugleistung wirtsuchender und bluternährter weiblicher Anopheles arabiensis, ernährt von Rinderurin und Harnstoff. Weibliche Mücken, die sich mit einer Diät aus frischem und gealtertem Rinderurin, verschiedenen Konzentrationen von Harnstoff, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O) ernährten, wurden in einem Flugmühlentest an einen horizontalen, sich frei drehenden Arm gebunden (oben). Die Gesamtdistanz und die Anzahl der pro Stunde über 24 Stunden geflogenen Kämpfe (Scotophase: grau; Photophase: weiß) wurden für jede Diät sowohl für Wirt suchende (links) als auch für bluternährte (rechts) Weibchen aufgezeichnet. Die durchschnittliche Distanz und die durchschnittliche Anzahl der Kämpfe werden rechts neben den Tagesaktivitätsdiagrammen angezeigt. Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar. Zur statistischen Analyse siehe den Haupttext

Im Allgemeinen folgten die gesamten Flugaktivitäten der wirtsuchenden Weibchen einem ähnlichen Muster wie die über den 24-Stunden-Zeitraum zurückgelegten Distanzen. Die aufgenommene Nahrung wirkte sich signifikant auf die durchschnittliche geflogene Distanz aus (F(5, 138) = 28,27, p < 0,0001), wobei wirtsuchende Weibchen, die 72 Stunden alten Urin zu sich genommen hatten, deutlich längere Strecken zurücklegten als alle anderen Diäten (p < 0,0001). Mit Saccharose gefütterte Mücken fliegen längere Strecken als solche, die mit frischem (p = 0,022) und 24 Stunden gealtertem Urin (p = 0,022) gefüttert wurden. Im Gegensatz zu den Flugaktivitätsmustern, die für die Urindiäten beschrieben wurden, zeigten wirtsuchende Weibchen, die mit Harnstoff gefüttert wurden, eine kontinuierliche Flugaktivität im Verlauf des 24-Stunden-Zeitraums mit einem Aktivitätsmaximum in der zweiten Hälfte der Skotophase (Abb. 3). Während das Aktivitätsmuster ähnlich war, erhöhten wirtsuchende Weibchen, die mit Harnstoff gefüttert wurden, die durchschnittliche Flugstrecke abhängig von der aufgenommenen Konzentration signifikant (F(5, 138) = 1310,91, p < 0,0001). Wirtsuchende Weibchen, die sich von einer beliebigen getesteten Harnstoffkonzentration ernährten, flogen längere Strecken als diejenigen, die sich von Wasser oder Saccharose ernährten (p < 0,03).

Die Gesamtflugaktivität der mit Blut gefütterten Mücken war über den 24-Stunden-Zeitraum bei allen Diäten stabil und kontinuierlich, mit einem Anstieg der Aktivität in der zweiten Hälfte der Skotophase sowohl bei den mit Wasser gefütterten Weibchen als auch bei den mit Frischfutter gefütterten und 24 Stunden alten Mücken Urin (Abb. 3). Während die Urindiät die durchschnittliche Flugstrecke der bluternährten Weibchen signifikant beeinflusste (F(5, 138) = 4,83, p = 0,0004), hatte die Harnstoffdiät keinen erkennbaren Einfluss (F(5, 138) = 1,36, p = 0,24). . Nur mit Blut gefütterte Weibchen, die mit 24 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden, zeigten im Vergleich zu den anderen Urin- und Kontrollfuttermitteln eine längere durchschnittliche Flugdistanz (frisch, p = 0,0091; 72 h, p = 0,0022; 168 h, p = 0,001; Saccharose, p =). 0,0017; dH2O, p = 0,036).

Die Auswirkung der Urin- und Harnstofffütterung auf die Fortpflanzungsparameter wurde in einem Eiablage-Bioassay bewertet (Abb. 4A) und anhand der Anzahl der pro Weibchen gelegten Eier sowie der Größe der Eier und der frisch geschlüpften Larven im ersten Stadium untersucht. Die Anzahl der von An gelegten Eier. arabiensis-Weibchen, die mit Urin gefüttert wurden, variierten mit der Ernährung (F(5, 222) = 4,38, p = 0,0008; Abb. 4B). Weibchen, die nach der Blutmahlzeit mit 24 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden, legten deutlich mehr Eier als bei der Fütterung mit anderen Urindiäten und ähnelten denen der mit Saccharose gefütterten Weibchen (Abb. 4B). Ebenso unterschied sich die Größe der Eier, die von mit Urin gefütterten Weibchen gelegt wurden, je nach Ernährung (F(5, 209) = 12,85, p < 0,0001), wobei Weibchen, die mit 24 Stunden gealtertem Urin und Saccharose gefüttert wurden, deutlich größere Eier legten als solche, die mit Wasser gefüttert wurden , während Eier von Weibchen, die mit 168 Stunden gealtertem Urin gefüttert wurden, deutlich kleiner waren (Abb. 4C). Darüber hinaus wirkte sich die Urinernährung signifikant auf die Larvengröße aus (F(5, 187) = 7,86, p < 0,0001), wobei deutlich größere Larven aus Eiern schlüpften, die von Weibchen gelegt wurden, die sich von 24 Stunden und 72 Stunden gealtertem Urin ernährten, als aus den Eiern von mit Wasser gefütterte und 168 Stunden alte, mit Urin gefütterte Weibchen (Abb. 4D).

Fortpflanzungsleistung weiblicher Anopheles arabiensis, gefüttert mit Rinderurin und Harnstoff. Mit Blut gefütterte weibliche Mücken ernährten sich über einen Zeitraum von 48 Stunden mit einer Diät, die aus frischem und gealtertem Rinderurin, verschiedenen Konzentrationen von Harnstoff, Saccharose (10 %) und destilliertem Wasser (H2O) bestand, und wurden dann in einen Bioassay mit Zugang zu einer Eiablage gegeben Substrat für 48 Stunden (A). Die Anzahl der Eier (B, E), die Größe der Eier (C, F) und die Größe der Larven (D, G) wurden maßgeblich durch die bereitgestellte Ernährung beeinflusst (Rinderurin: B–D; Harnstoff: E–G). Der Mittelwert für jeden Parameter, der mit unterschiedlichen Buchstabenbezeichnungen gemessen wird, unterscheidet sich signifikant voneinander (einseitige Varianzanalyse mit einer Tukey-Post-hoc-Analyse; p < 0,05). Fehlerbalken stellen den Standardfehler des Mittelwerts dar

Als primärer stickstoffhaltiger Bestandteil des Urins hatte Harnstoff, wenn er bluternährten Weibchen als Nahrung angeboten wurde, unterschiedliche und signifikante Auswirkungen auf alle untersuchten Reproduktionsparameter. Die Anzahl der Eier, die von Weibchen gelegt wurden, die nach der Blutmahlzeit mit Harnstoff gefüttert wurden, unterschied sich je nach Harnstoffkonzentration (F(11, 360) = 4,69; p < 0,0001), wobei Weibchen mit Harnstoffkonzentrationen zwischen 134 µM und 1,34 mM gefüttert wurden mehr Eier legen (Abb. 4E). Weibchen, die mit Harnstoffkonzentrationen von 134 µM oder mehr gefüttert wurden, legten größere Eier als mit Wasser gefütterte Weibchen (F(10, 4245) = 36,7; p < 0,0001; Abb. 4F), wohingegen die Larvengröße von ähnlichen Harnstoffkonzentrationen beeinflusst wurde durch die Mutter (F(10, 3305) = 37,9; p < 0,0001) war variabler (Abb. 4G).

Die allgemeine Anziehungskraft auf die flüchtigen Kopfraumextrakte des Rinderurins von Wirt suchenden An. arabiensis wurde, wie in einem Glasröhrchen-Olfaktometer beurteilt (Abb. 5A), signifikant durch das Alter des Urins beeinflusst (χ2 = 15,9, df = 4, p = 0,0032; Abb. 5B). Eine Post-hoc-Analyse ergab, dass der 24-Stunden-Uringeruch im Vergleich zu allen anderen Behandlungen ein signifikant höheres Maß an Anziehung hervorrief (72 Stunden: p = 0,0060, 168 Stunden: p = 0,012, Pentan: p = 0,00070), mit Ausnahme des Geruchs von frischem Urin (S = 0,13; Abb. 5B). Während es keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtattraktivität des Uringeruchs durch blutgenährte Mücken gab (χ2 = 8,78, df = 4, p = 0,067; Abb. 5C), wurde festgestellt, dass diese Weibchen deutlich stärker vom flüchtigen Extrakt im Kopfraum angezogen wurden von 72 Stunden gealtertem Urin im Vergleich zur Kontrolle (p = 0,0066; Abb. 5C).

Verhaltensreaktion von Wirt suchenden und mit Blut gefütterten Anopheles arabiensis auf natürlichen und synthetischen Rinderuringeruch. Diagramm des Glasröhren-Olfaktometers (A). Anziehungskraft auf die flüchtigen Kopfraumextrakte von frischem und gealtertem Rinderurin von wirtsuchenden (B) und bluternährten (C) Mücken. Die Antennenreaktionen des Wirt suchenden An. arabiensis zu fraktionierten Headspace-Extrakten aus frischem (D), 24 Stunden (E), 72 Stunden (F) und 168 Stunden (G) gealtertem Rinderurin werden gezeigt. Elektroantennographische Detektionsspuren (EAD) zeigen Spannungsänderungen als Reaktion auf die bioaktiven Verbindungen im Kopfraum, die aus dem Gaschromatographen eluieren und vom Flammenionisationsdetektor (FID) erkannt werden. Der Maßstabsbalken zeigt die Reaktionsamplitude (mV) im Vergleich zur Retentionszeit (s) an. Die Identität und Freisetzungsrate (µg h−1) der bioaktiven Verbindungen sind angegeben. Ein einzelnes Sternchen (*) weist auf konstant niedrige Amplitudenantworten hin. Doppelte Sternchen (**) weisen auf nicht reproduzierbare Antworten hin. Wirtssuchend (H) und bluternährt (I) An. arabiensis werden von den synthetischen Geruchsmischungen aus frischem und gealtertem Rinderurin unterschiedlich angezogen. Der mittlere Anteil der angelockten Mücken mit unterschiedlichen Buchstabenbezeichnungen unterscheidet sich signifikant voneinander (einseitige Varianzanalyse mit einer Tukey-Post-hoc-Analyse; p < 0,05). Fehlerbalken geben den Standardfehler des Anteils an

Weiblich An. arabiensis zeigte 72 Stunden und 120 Stunden nach der Blutmahlzeit keine Präferenz für die flüchtigen Headspace-Extrakte von frischem und gealtertem Rinderurin gegenüber denen der Pentan-Kontrolle während der Eiablage (χ2 = 3,07, p > 0,05; Zusatzdatei 1: Abb . S1).

Für weibliche An. arabiensis identifizierten die GC-EAD- und GC-MS-Analysen acht, sechs, drei und drei bioaktive Verbindungen in den flüchtigen Headspace-Extrakten von frischem, 24 Stunden, 72 Stunden und 168 Stunden gealtertem Rinderurin (Abb. 5D – G). Trotz des beobachteten Unterschieds in der Anzahl der Verbindungen, die eine elektrophysiologische Reaktion hervorrufen, war die Mehrheit dieser Verbindungen in jedem der flüchtigen Headspace-Extrakte vorhanden, die aus frischem und gealtertem Urin gesammelt wurden. Daher wurden für jeden Extrakt nur Verbindungen in die weiteren Analysen einbezogen, die über dem Schwellenwert liegende physiologische Reaktionen der weiblichen Antennen hervorriefen.

Die gesamte flüchtige Freisetzungsrate der bioaktiven Verbindungen in den Headspace-Sammlungen stieg von 29 µg h−1 in frischem Urin auf 242 µg h−1 in 168 Stunden gealtertem Urin, hauptsächlich aufgrund des Anstiegs von p- und m-Kresol als Phenol. Im Gegensatz dazu nahm die Freisetzungsrate anderer Verbindungen, beispielsweise 2-Cyclohexen-1-on und Decanal, mit zunehmendem Alter des Urins ab, was mit der beobachteten Abnahme der Signalintensität (Häufigkeit) im Chromatogramm korreliert (Abb. 5D). –G linkes Feld) und in der physiologischen Reaktion auf diese Verbindungen (Abb. 5D-G rechtes Feld).

Insgesamt schienen synthetische Mischungen, die annähernd dem natürlichen Verhältnis bioaktiver Verbindungen entsprechen, die in den flüchtigen Headspace-Extrakten von frischem und gealtertem Urin identifiziert wurden (Abb. 5D–G), keine signifikante Anziehungskraft bei der Wirtssuche hervorzurufen (χ2 = 8,15, df = 4, p = 0,083; Abb. 5H) oder bei bluternährten Mücken (χ2 = 4,91, df = 4, p = 0,30; Abb. 5I). Ein paarweiser Post-hoc-Vergleich zwischen den Behandlungen ergab jedoch eine signifikante Anziehungskraft wirtsuchender Mücken auf die synthetische Mischung aus 24 Stunden gealtertem Urin im Vergleich zur Pentan-Kontrolle (p = 0,0086; Abb. 5H).

Um die Rolle einzelner Komponenten in der synthetischen Mischung aus 24 Stunden gealtertem Urin zu beurteilen, wurden sechs subtraktive Mischungen, aus denen einzelne Verbindungen entfernt wurden, in einem Y-Röhrchen-Assay mit der Gesamtmischung verglichen. Bei wirtssuchenden Mücken hatte die Subtraktion einzelner Verbindungen aus der Gesamtmischung einen signifikanten Einfluss auf die Verhaltensreaktion (χ2 = 19,63, df = 6, p = 0,0032; Zusatzdatei 1: Abb. S2A), wobei alle subtraktiven Mischungen weniger attraktiv waren als die Vollmischung. Im Gegensatz dazu hatte die Entfernung einzelner Verbindungen aus der vollsynthetischen Mischung keinen Einfluss auf die Verhaltensreaktion von mit Blut gefütterten Mücken (χ2 = 11,38, df = 6, p = 0,077), mit Ausnahme von Decanal, das zu einem verringerten Spiegel führte Anziehungskraft im Vergleich zur Vollmischung (p = 0,022; Zusatzdatei 1: Abb. S2B).

Die Wirksamkeit der synthetischen Mischung aus 24 Stunden gealtertem Rinderurin zur Anlockung von Mücken unter Feldbedingungen wurde über zehn Nächte in einem Malaria-endemischen ländlichen Dorf in Äthiopien bewertet (Abb. 6A). Insgesamt wurden 4861 Mücken gefangen und identifiziert, davon waren 45,7 % An. gambiae sl, 18,9 % waren Anopheles pharoensis und 35,4 % waren Culex spp. (Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Anopheles arabiensis war das einzige Mitglied der An. Gambiae-Artenkomplex, der durch PCR-Analyse identifiziert werden soll. Im Durchschnitt wurden pro Nacht 320 Mücken gefangen, wobei die mit der synthetischen Mischung beköderten Fallen mehr Mücken fingen als die gepaarten Fallen ohne die Mischung (χ2(0, 3196) = 170,0, p < 0,0001). In jeder der fünf Kontrollnächte zu Beginn, in der Mitte und am Ende des Versuchs wurden Fallen ohne Köder aufgestellt. In jedem Fallenpaar wurden ähnlich viele Mücken gefangen, was zeigt, dass es keine Verzerrung zwischen den Häusern gab (χ2(0, 1665) = 9 × 10–13, p > 0,05) und es zu keinem Rückgang der Population während des Untersuchungszeitraums kam. Im Vergleich zu den Kontrollfallen wurden in Fallen, die die synthetische Mischung enthielten, deutlich mehr Mücken gefangen: wirtsuchend (χ2(0, 2107) = 138,7, p < 0,0001), kürzlich mit Blut gefüttert (χ2(0, 650) = 32,2). , p < 0,0001) und schwanger (χ2(0, 228) = 6,27, p = 0,0123; Zusatzdatei 1: Tabelle S1). Dies spiegelte sich auch in der Gesamtzahl der gefangenen Mücken wider: wirtsuchende > blutgenährte > trächtige > halbträchtige > Männchen.

Feldbewertung der Wirksamkeit der 24-Stunden-Geruchsmischung aus synthetischem Rinderurin. Die Feldversuche wurden in Süd-Zentral-Äthiopien (Karte) in der Nähe der Stadt Meki (Einfügung) durchgeführt, wobei Lichtfallen des Centers of Disease Control (CDC) (rechts) in gepaarten Häusern im lateinischen Quadratdesign (Luftkarte) verwendet wurden (A ). CDC-Lichtfallen, die mit dem synthetischen Geruch beködert wurden, zogen unterschiedlich weibliche Anopheles arabiensis (B) an und fingen sie ein, nicht jedoch Anopheles pharoensis (C), ein Effekt, der vom physiologischen Zustand abhängig war. Darüber hinaus fingen die Fallen deutlich mehr wirtssuchende Culex-Arten. (D) im Vergleich zu den Kontrollen. Die Balken auf der linken Seite stellen die durchschnittlichen Auswahlindizes von Mücken dar, die in gepaarten Geruchsfallen (grün) und Kontrollfallen (offen) gefangen wurden (N = 10), während die Balken auf der rechten Seite die Auswahlindizes von Mücken darstellen, die in gepaarten Kontrollfallen (offen) gefangen wurden; N = 5). Sternchen geben den Grad der statistischen Signifikanz an (*p = 0,01 und ***p < 0,0001)

Die drei Arten wurden unterschiedlich in den Fallen gefangen, die die synthetische Mischung enthielten. Eine deutlich höhere Anzahl von Wirtssuchenden (χ2(1, 1345) = 71,7, p < 0,0001), blutgenährten (χ2(1, 517) = 16,7, p < 0,0001) und trächtigen (χ2(1, 180) = 6,11, p = 0,0134) An. arabiensis wurden in Fallen gefangen, die die synthetische Mischung freisetzten (Abb. 6B), wohingegen kein Unterschied in der Anzahl der An. pharoensis in verschiedenen physiologischen Zuständen gefunden (Abb. 6C). Bei den Culex-Arten wurde nur festgestellt, dass die Anzahl der wirtssuchenden Mücken in den mit der synthetischen Mischung beköderten Fallen signifikant höher war (χ2(1, 1319) = 12,6, p = 0,0004; Abb. 6D) im Vergleich zu den Kontrollfalle.

Wirtslockfallen, die abseits potenzieller Wirte zwischen der Brutstätte und einer ländlichen Dorfgemeinschaft in Äthiopien aufgestellt wurden, wurden verwendet, um zu beurteilen, ob Malariamücken den Uringeruch von Rindern als Hinweis auf ihren Wirtslebensraum nutzen. In Abwesenheit des Wirtssignals Hitze wurden keine Mücken gefangen, mit oder ohne Vorhandensein von Rinderuringeruch (Zusatzdatei 1: Abb. S3). Allerdings wurden in Gegenwart von Hitze und Rinderuringeruch weibliche Malariamücken angelockt und gefangen, wenn auch in geringer Zahl, unabhängig vom Alter des Urins (χ2(5, 25) = 2,29, p = 0,13; Zusatzdatei 1 : Abb. S3). Im Gegensatz dazu fing die Wasserkontrolle bei Hitze keine Malariamücken (Zusatzdatei 1: Abb. S3).

Malariamücken erwerben und verteilen stickstoffhaltige Verbindungen durch kompensatorische Fütterung mit Rinderurin, also Pfützenbildung, um lebensgeschichtliche Merkmale zu verbessern, ähnlich wie bei anderen Insekten [2, 4, 24, 25, 26]. Rinderurin ist eine leicht verfügbare und erneuerbare Ressource, die in enger Verbindung mit Rastplätzen, z. B. Viehställen und hoher Vegetation in der Nähe von ländlichen Haushalten und Eiablageplätzen, für Malariaüberträger vorkommt. Weibliche Mücken lokalisieren diese Ressource über den Geruchssinn und sind in der Lage, die Aufnahme stickstoffhaltiger Verbindungen im Urin zu regulieren, einschließlich des wichtigsten stickstoffhaltigen Bestandteils des Urins, Harnstoff [15, 16]. Abhängig vom physiologischen Zustand der weiblichen Mücke werden die Nährstoffe im Urin verteilt, um die Flugaktivität und das Überleben bei wirtsuchenden Weibchen sowie die Überlebens- und Fortpflanzungsmerkmale bei bluternährten Individuen während ihres ersten gonotrophen Zyklus zu verbessern. Daher spielt die Urinpfütze eine wichtige Nährstoffrolle für Malariaüberträger, die sich als unterernährte Erwachsene ausbreiten [8], indem sie weiblichen Mücken die Möglichkeit gibt, durch risikoarme Fütterung lebenswichtige Stickstoffverbindungen zu erhalten. Dieser Befund hat erhebliche epidemiologische Konsequenzen, da Frauen ihre Lebenserwartung, Aktivität und Fortpflanzungsleistung erhöhen, was sich allesamt auf die Vektorkapazität auswirkt. Darüber hinaus könnte dieses Verhalten in zukünftigen Vektormanagementprogrammen zum Ziel werden.

Das VOC-Profil des Urins verändert sich mit zunehmendem Alter aufgrund der mikrobiellen Aktivität [15, 27, 28, 29]. Wirtsuchendes Weibchen An. arabiensis werden von den VOCs von frischem und 24 Stunden gealtertem Urin angezogen (diese Studie, [12, 13]), was sich von dem unterscheidet, das für andere Dipteren, einschließlich Tsetse und Tabaniden, gefunden wurde, die VOCs von älterem Urin bevorzugen [27, 30]. , 31]. Die Gesamtkomplexität der VOCs nimmt mit zunehmendem Alter des Urins zu, wobei Phenol und Phenolderivate die vorherrschenden VOCs sind (diese Studie, [27, 32]). Während Mischungen phenolischer VOCs ausreichen, um bei Tsetsefliegen und Tabaniden eine Anziehungskraft auszulösen [30,31,32,33], gelingt dies bei An nicht. arabiensis, wie von Mahande et al. bestätigt. [13] und Kweka et al. [12]. Im Gegensatz dazu locken die Mischungen von über die Antenne erfassten VOCs weibliche An. arabiensis sind komplexer. Diese Mischungen enthalten auch Phenol, p- und m-Kresol, allerdings mit geringeren Freisetzungsraten als im älteren Urin. Eine synthetische Mischung dieser phenolischen Verbindungen zusammen mit drei zusätzlichen antennenaktiven VOCs ist erforderlich, um die Verhaltensreaktion wirtsuchender Weibchen auf Rinderurin unter Laborbedingungen nachzubilden. Dies deutet auf eine evolutionär konservierte Funktion phenolischer Verbindungen bei Dipteren hin, allerdings ist der Kontext, in dem diese phenolischen Verbindungen dargestellt werden, für verschiedene Arten adaptiv. Bei der Beurteilung unter Feldbedingungen löste dieselbe Mischung eine Anziehungskraft auf Wirt suchende An aus. arabiensis und Culex spp. Weibchen, aber nicht von An. pharoensis, wobei der Schwerpunkt auf einer konservierten, aber artabhängigen Reaktion liegt. Es wurde vorgeschlagen, dass flüchtige organische Verbindungen (VOCs) im Urin von Rindern als Wirtshabitat-Hinweise dienen, d. h. als weitreichende Lockstoffe, die auf die Anwesenheit eines potenziellen Wirts in einem bestimmten Gebiet hinweisen, für Tsetsefliegen, Tabaniden und andere Nicht-Culicidae-Fliegen [34]. Mücken scheinen jedoch Rinderurin nicht als Wirtshabitat-Hinweis zu verwenden, was auf eine unterschiedliche ökologische Funktion bei Culicidae (Mücken) und Nicht-Culicidae-Fliegen hinweist.

Während der synthetische Geruch von 24 Stunden gealtertem Urin kürzlich geblutete und trächtige An. arabiensis im Freiland, wurde dies unter Laborbedingungen nicht beobachtet. Im Gegensatz dazu zeigten mit Blut gefütterte Weibchen eine starke Anziehungskraft auf die feuchte Hintergrundluft, wobei die VOCs des Rinderurins kaum oder gar keine Wirkung hatten. Diese Verhaltensergebnisse im Labor werden wahrscheinlich durch die Tatsache verfälscht, dass Feuchtigkeit selbst ein starker Lockstoff für die Präoviposition ist [35], aber eine Voraussetzung für den Bioassay ist. Es wurde vorgeschlagen, dass Rinderurin die Eiablage trächtiger Mücken reguliert [14], dies wurde jedoch in dieser Studie nicht bestätigt. Während Rinderurin die Eiablage möglicherweise nicht stimuliert, kann nicht ausgeschlossen werden, dass trächtige Mücken Urin aufnehmen, der sich an oder neben Eiablagestellen ablagert. Da die Eiablage durch Rinderurin nicht beeinflusst wurde, wurden andere plausible Erklärungen für die Anziehung von Mücken durch Rinderurin untersucht.

Frischer Urin enthält hauptsächlich Salze und stickstoffhaltige Verbindungen, zwei Nährstoffklassen, nach denen Insekten häufig suchen, wenn sie Nahrungsergänzungsmittel zur Steigerung ihrer Fitness nutzen [2]. Wirtssuchender und blutgenährter An. arabiensis nehmen aktiv Rinderurin auf, und zwar in einer ähnlichen Menge wie die Wasseraufnahme, unabhängig vom Alter des Urins, was auf ähnliche Gesamtstickstoffwerte in frischem und gealtertem Urin zurückzuführen sein kann. Mit zunehmendem Alter des Rinderurins nutzen Mikroben die stickstoffhaltigen Verbindungen im Urin, insbesondere die Hydrolyse von Harnstoff zu Ammoniak, was zu einer sich verändernden Komplexität der mikrobiellen Gemeinschaften führt [15]. Während Weibchen keine offensichtliche Vorliebe für die Nahrungsaufnahme von frischem oder gealtertem Urin zeigen, zeigen Mücken eine dosisabhängige Reaktion auf Harnstoff, was zeigt, dass sowohl wirtssuchende als auch bluternährte Mücken ihre Aufnahme stickstoffhaltiger Verbindungen regulieren. Wirtssuchende Mücken nehmen ein breites Spektrum an Harnstoffkonzentrationen auf. Diese Weibchen weisen jedoch optimale Harnstoffaufnahmemengen bei Konzentrationen auf, die denen in frischem und 24 Stunden gealtertem Rinderurin ähneln [15, 16] und sich nicht von der Saccharosekontrolle unterscheiden. Während mit Blut gefütterte Mücken geringere Mengen an Harnstoff und Wasser aufnehmen als wirtsuchende Weibchen, weisen diese Weibchen eine niedrigere Reaktionsschwelle auf Harnstoff auf, da kürzlich mit Blut gefütterte Weibchen durch die vorherige Mahlzeit eingeschränkt werden. Mücken sind nicht in der Lage, Harnstoff zu verstoffwechseln und nutzen wahrscheinlich Darmbakterien, die Ureasen besitzen, um Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren [36, 37]. Mitteldarmgewebe und Fettkörper von Mücken sind in der Lage, Ammoniak in die Aminosäuren Glutamat, Glutamin, Alanin und Prolin umzuwandeln [38, 39], die wichtige Bestandteile von Dotterproteinen sind und im Fall von Prolin als Aminosäuren verwendet werden können Energiequelle für den Flug [40].

Die Zuordnungsmuster assimilierter stickstoffhaltiger Nährstoffe aus dem Urin, einschließlich Harnstoff, sind nicht unabhängig, da diese Nährstoffe als Funktion des physiologischen Zustands für Überleben, Flucht und Fortpflanzung zugewiesen werden, um die bei der Wirtssuche und Bluternährung nachgewiesenen lebensgeschichtlichen Merkmale bereitzustellen Mücken. Dies steht im Einklang mit dem allgemeinen Aspekt der Nährstoffverteilung bei anderen Insekten, bei denen die Merkmale des Lebensverlaufs durch einen oder mehrere limitierende Nährstoffe eingeschränkt werden [1, 2]. Die Notwendigkeit, Nährstoffe mehr als einem Merkmal gleichzeitig zuzuordnen, kann zu physiologischen Kompromissen zwischen diesen Merkmalen führen [1], wie paarweise für die Wirtssuche (Flucht vs. Überleben) und die Bluternährung ( (Überleben vs. Fortpflanzung) Mücken. Es hat sich gezeigt, dass die Notwendigkeit, den Erwerb einer Lebensmittelart zu steigern, die einen limitierenden Nährstoff enthält, zu einem übermäßigen Verzehr von Nährstoffen führt, die sich negativ auf ein anderes Verteilungsziel auswirken [1, 41]. Solche Kompromisse könnten erklären, warum wirtssuchende weibliche Mücken von 72 Stunden altem Urin angezogen werden und diesen aufnehmen, der toxische Mikrobiota enthält [15], was die geflogene Distanz erhöht, aber zu einer deutlich verkürzten Lebensdauer führt. Andererseits ermöglicht die Aufnahme überschüssiger Nährstoffe im 24-Stunden-Urin durch bluternährte Weibchen die Zuordnung dieser Ressourcen zu mehr als einem Merkmal, nämlich Überleben, Flucht und Fortpflanzung. Dies zeigt, dass die kompensatorische Ernährung mit Urin zu ähnlichen Zwecken genutzt werden kann wie mehrere Blutmahlzeiten innerhalb eines gonotrophen Zyklus [42]. Dieser Allokationsrahmen [1, 3] bietet ein mechanistisches Verständnis der Muster der Lebensgeschichte und der Art und Weise, wie Ressourcen für Überleben, Ausbreitung und Reproduktion zugewiesen werden.

Eine kompensatorische Fütterung stickstoffhaltiger Verbindungen in Form mehrerer Blutmahlzeiten wurde in An gezeigt. gambiae sl ist entweder für die Eientwicklung bei Weibchen mit geringen Teneriumreserven erforderlich oder dient zur Verbesserung der Anzahl und des Zustands der sich in einem einzigen gonotrophen Zyklus entwickelnden Eier [43,44,45,46]. Allerdings ist die Bluternährung riskant und stellt für das Weibchen einen Kompromiss zwischen Fortpflanzung und Überleben dar [47], was eine andere, risikoarme Quelle für stickstoffhaltige Verbindungen, z. B. Rinderurin, zu einer adaptiven Alternative macht. Die erhöhte Überlebensrate sowie die erhöhte Anzahl und Größe der gelegten Eier nach einer kompensatorischen Urin- oder Harnstoffmahlzeit durch ein mit Blut gefüttertes Weibchen spiegeln das wider, was nach mehreren Blutmahlzeiten beobachtet wird [43, 45, 46]. Dies legt nahe, dass An. arabiensis kann den Kompromiss zwischen dem Bedarf an Stickstoffressourcen zur Verbesserung der Fortpflanzungsmerkmale und dem Überleben durch die Verwendung von Rinderurin minimieren.

Mit Blut gefütterte Mücken verteilen den Großteil der stickstoffhaltigen Verbindungen aus der kompensatorischen Nahrungsaufnahme auf die Fortpflanzung und teilweise auf das Überleben, während wirtssuchende Mücken diese hauptsächlich als Treibstoff für den Flug nutzen [48], analog zu dem, was für andere Insekten beschrieben wurde [49, 50]. . Der unmittelbare und anhaltende Anstieg der Flugaktivität von Wirt suchenden Weibchen nach einer Harnstoffmahlzeit legt nahe, dass diese Ressource direkt zur Förderung der Flugaktivität genutzt werden kann, möglicherweise durch die Kombination der zuvor beschriebenen Umwandlung von Ammoniak in Prolin [39] und seine weitere Oxidation von Prolin zum Treibstoff für die Flugmuskulatur [40, 48]. Das Aktivitätsmuster im Morgengrauen, das wirtsuchende Weibchen zeigten, die sich mit frischem Urin ernährten, spiegelt das bei An beobachtete Muster wider. Gambiae-Weibchen, die sich an der kompensatorischen Bluternährung beteiligen [10]. Wirtssuchende Weibchen, die mit 24-Stunden- und 168-Stunden-Urin gefüttert werden, zeigen dagegen während der gesamten Photophase eine abnormale Aktivität, was darauf hindeutet, dass diese Weibchen während dieser Zeit möglicherweise auf der Suche nach Nährstoffen sind. Die Fütterung mit 72 Stunden gealtertem Urin führte zu ähnlichen Aktivitätsmustern wie nach der Harnstofffütterung, was den hohen Ammoniakspiegel widerspiegelt, der zu diesem Zeitpunkt aufgrund der mikrobiellen Aktivität in der Nahrung vorhanden war [15]. Somit haben Mücken die Fähigkeit, Rinderurin und seinen stickstoffhaltigen Hauptbestandteil Harnstoff als Treibstoff für den Flug zu nutzen.

Malariamücken zeigen komplexe Verhaltens- und physiologische Strategien zur Anpassung an ihre Umgebung. Die Fütterung mit Rinderurin gleicht die Notwendigkeit der Einnahme mehrerer Blutmahlzeiten aus, indem sie die Lebensmerkmale zustandsabhängig verbessert. Dies wirkt sich wahrscheinlich auf die Vektorkapazität aus, indem die Wahrscheinlichkeit des täglichen Überlebens und die Vektordichte erhöht werden, während gleichzeitig die Wechselwirkung zwischen dem Vektor und dem Wirt verringert wird, indem die Notwendigkeit mehrerer Blutmahlzeiten verringert wird. Ob Insektizide und antiparasitäre Medikamente, die Rindern verabreicht werden, im Urin der Rinder vorhanden sind und sich somit negativ auf den Gewinn von lebensgeschichtlichen Merkmalen des Vektors auswirken oder die Entwicklung von Resistenzen gegen diese Behandlungen beschleunigen, bedarf weiterer Untersuchungen. Urinmahlzeiten stellen eine alternative Stickstoffquelle außerhalb des Blutes dar und reduzieren die Anzahl unterernährter Weibchen, die vor der Eientwicklung eine Vorblutmahlzeit zur Energiegewinnung benötigen. Weitere Studien sind erforderlich, um zu beurteilen, ob die Neigung zur Urinaufnahme und ihre Auswirkungen vom Alter unterschiedlich beeinflusst werden, insbesondere bei älteren Frauen, die den Parasiten auf den Menschen übertragen können. Darüber hinaus besteht Bedarf, die Wirkung dieser Diät auf das Überleben und die Entwicklung von Malariaparasiten zu analysieren. Eine kompensatorische Fütterung mit Rinderurin oder anderen stickstoffreichen Ressourcen sollte in zukünftigen Modellen der Vektorkapazität berücksichtigt werden. Zu diesem Zweck sind weitere Studien erforderlich, um die natürliche Rolle der Urinfütterung von Rindern bei Malariaüberträgern zu ermitteln und zu untersuchen, wie dieses Verhalten in zukünftigen Vektormanagementstrategien manipuliert werden kann. Daher kann der hier entwickelte synthetische Rinderuringeruch beispielsweise bei Massenfangeinsätzen auf lokaler oder regionaler Ebene zur Bekämpfung von Malariaüberträgern eingesetzt werden.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seinen Zusatzdateien verfügbar.

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Die Autoren danken außerdem Dr. Elsa Quillery für ihre Unterstützung bei der PCR-Analyse von im Feld gesammelten Mücken und Yared Debebe für seine Unterstützung bei den HDT-Experimenten.

Open-Access-Finanzierung durch die Schwedische Universität für Agrarwissenschaften. Wir danken dem Schwedischen Forschungsrat (VR/2014-3331) für die Finanzierung dieser Studie.

Abteilung für Zoologische Wissenschaften, Universität Addis Abeba, PO. Box 1176, Addis Abeba, Äthiopien

Mengistu David & Habte Tekie

Abteilung für Biologie, Debre Berhan University, PO. Box 445, Debre Berhan, Äthiopien

Mengistu Dawit

Abteilung für Chemische Ökologie, Abteilung für Pflanzenschutzbiologie, Schwedische Universität für Agrarwissenschaften, Alnarp, Schweden

Mengistu Dawit, Sharon R. Hill, Göran Birgersson und Rickard Ignell

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RI und SRH konzipierten die Studie. MDB sammelte Daten. MDB und SRH führten die statistischen Analysen durch. GB, HT, SRH und RI überwachten die Studie. MDB, SRH und RI haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Rickard Ignell.

Die ethische Genehmigung wurde vom Institutional Research Ethics Review Board, College of Natural Sciences (CNS-IRB) der Universität Addis Abeba (IRB/022/2016) gemäß den Richtlinien der World Medical Association Declaration of Helsinki eingeholt. Die Zustimmung jedes Haushaltsvorstands wurde mit Unterstützung von Gesundheitsberatern eingeholt und von der örtlichen Verwaltung auf Bezirks- und „Kebele“-Ebene bestätigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass kein konkurrierendes Interesse besteht.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Tabelle S1. Art, Geschlecht und gonotropher Zustand der Mücken, die in CDC-Lichtfallen gefangen wurden, die mit der synthetischen Geruchsmischung aus 24 Stunden gealtertem Rinderurin oder einer Heptan-Kontrolle beködert wurden. Tabelle S2. Synthetische Verbindungen für elektrophysiologische und Verhaltensanalysen. Abb. S1. Mit Blut gefütterte Anopheles arabiensis bevorzugen keine Eiablage für die flüchtigen Kopfraumextrakte von frischem und gealtertem Rinderurin. Die Buchstabenbezeichnungen weisen keinen signifikanten Unterschied voneinander auf (einseitige Varianzanalyse mit einer Tukey-Post-hoc-Analyse; p > 0,05). Fehlerbalken geben den Standardfehler des Anteils an. Abb. S2. Verhaltensreaktionen von wirtsuchenden (A) und blutgenährten (B) Anopheles arabiensis auf die vollständigen und subtraktiven synthetischen Mischungen von 24 Stunden gealtertem Rinderurin. Die Entfernung einzelner Komponenten aus der synthetischen Mischung (offene Kreise) beeinflusste die Reaktion der Weibchen in beiden physiologischen Zuständen unterschiedlich und signifikant. Unterschiedliche Kleinbuchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin, wie durch eine einseitige Varianzanalyse gefolgt von einer Dunnett-Post-hoc-Analyse ermittelt (p < 0,05). Fehlerbalken stellen den Standardfehler der Proportionen dar. Abb. S3. Rinderurin verstärkt die Fänge von Wirts-Köderfallen nur in Gegenwart des Wirtssignals Hitze. Wirts-Köderfallen fingen Malariamücken nur auf einer verlassenen Weide zwischen der Brutstätte und dem Dorf in Gegenwart von Hitze und Rinderurin (frisch oder gealtert), aber nicht von beidem allein. Fehlerbalken geben den Standardfehler des Mittelwerts an.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 07. Januar 2022

Angenommen: 10. Mai 2022

Veröffentlicht: 11. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-022-04179-6

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