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Nov 04, 2023

Richtlinien zur Messung reaktiver Sauerstoffspezies und oxidativer Schäden in Zellen und in vivo

Nature Metabolism Band 4,

Nature Metabolism Band 4, Seiten 651–662 (2022)Diesen Artikel zitieren

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In den biologischen Wissenschaften tauchen vielfältige Rollen reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und ihre Folgen für Gesundheit und Krankheit auf. Diese Entwicklung hat dazu geführt, dass Forscher, die mit der Komplexität von ROS und ihren Reaktionen nicht vertraut sind, kommerzielle Kits und Sonden einsetzen, um ROS und oxidativen Schaden unangemessen zu messen, und ROS (eine generische Abkürzung) so behandeln, als wäre es eine diskrete molekulare Einheit. Leider sind die Anwendung und Interpretation dieser Messungen mit Herausforderungen und Einschränkungen verbunden. Dies kann dazu führen, dass irreführende Behauptungen in die Literatur gelangen und den Fortschritt behindern, obwohl gut fundiertes Wissen darüber vorhanden ist, wie einzelne ROS, ihre Reaktionen, ihre Rolle als Signalmoleküle und die oxidativen Schäden, die sie verursachen können, am besten beurteilt werden können. In dieser Konsenserklärung beleuchten wir Probleme, die bei vielen häufig verwendeten Ansätzen zur Messung von ROS und oxidativem Schaden auftreten können, und schlagen Richtlinien für bewährte Verfahren vor. Wir hoffen, dass diese Strategien für diejenigen von Nutzen sein werden, deren Forschung eine Bewertung von ROS, oxidativem Schaden und Redoxsignalen in Zellen und in vivo erfordert.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) (Kasten 1) sind eng an der Redoxsignalisierung beteiligt, können aber in manchen Situationen auch zu oxidativen Schäden führen. Daher spielen sie sowohl physiologische als auch pathophysiologische Rollen in der Biologie1,2,3,4. Folglich müssen Forscher aus verschiedenen Bereichen häufig ROS messen, oxidative Ereignisse bewerten und ihre biologische Bedeutung untersuchen, indem sie Antioxidantien (Kasten 1) oder Inhibitoren verwenden, um die beobachteten Phänomene zu modulieren. Es sind viele Assays und kommerzielle Kits erhältlich, deren Verwendung und Interpretation sind jedoch anspruchsvoll und anfällig für Artefakte. Es gibt ein gut etabliertes Gebiet der Biophysik/Biochemie/Chemie, das sich auf die Identifizierung von ROS, ihren chemischen Reaktionen und Produkten oxidativer Schäden konzentriert. Allerdings kann diese Literatur, wie in vielen Spezialgebieten, für diejenigen, die außerhalb des Fachgebiets arbeiten, schwer zu interpretieren sein. Häufig entstehen Probleme durch die Abhängigkeit von kommerziellen Kits, die angeblich „ROS“ oder „oxidativen Schaden“ messen, oder durch die Verwendung von „Antioxidantien“ im Allgemeinen, wenn der Fortschritt das Verständnis spezifischer molekularer Mechanismen erfordert.

Um diese Punkte anzugehen, hat diese internationale Gruppe Richtlinien zur Nomenklatur und Messung von ROS, oxidativen Reaktionen und oxidativen Schäden festgelegt. Unser Schwerpunkt liegt auf den Techniken zur Messung von ROS und oxidativem Schaden. Diese können auf ihre Rolle in der Pathologie übertragen werden, es ist jedoch auch wichtig zu beachten, dass Veränderungen im ROS-Spiegel und daraus resultierende Veränderungen in der Aktivität redoxempfindlicher zellulärer Prozesse für das Gebiet der Redoxsignalisierung von zentraler Bedeutung sind1,2,3,4 . Wir hoffen, dass diese Richtlinien für Forscher nützlich sein werden, die Experimente auf diesem Gebiet durchführen. Diese Themen und in der Tat die von uns befürworteten Ansätze wurden in der Vergangenheit in zahlreichen Übersichtsartikeln behandelt1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, deren Lektüre Forschern dringend empfohlen wird. Hier destillieren wir die Kernpunkte, die dieser Konsenserklärung zugrunde liegen.

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) ist ein Sammelbegriff für von O2 abgeleitete Spezies, die reaktiver sind als O2 selbst. Der Begriff umfasst nicht nur das Superoxid-Radikalanion (O2•−) und einige andere Sauerstoffradikale, sondern auch einige nichtradikalische Derivate von O2 wie Wasserstoffperoxid (H2O2), hypochlorige Säure (HOCl) und Peroxynitrit/peroxysalpetrige Säure (ONOO−). /ONOOH). Daher sind alle Sauerstoffradikale ROS, aber nicht alle ROS sind Radikalspezies (letztere werden als Spezies mit einem oder mehreren ungepaarten Elektronen definiert). „Reaktiv“ ist ein relativer Begriff; O2•− und H2O2 reagieren selektiv mit biologischen Molekülen und lassen die meisten von ihnen unversehrt, während •OH alles angreift (Tabelle 1).

Antioxidans ist ein oft verwendeter Begriff, der jedoch schwer eindeutig zu definieren ist.

Wenn ROS in vivo erzeugt werden, kommen viele Antioxidantien ins Spiel. Ihre relative Bedeutung hängt ab von:

welche ROS in welcher Höhe und in welchem ​​Zeitraum generiert werden

wie und wo es erzeugt wird

welches Schadensziel durch ROS gemessen wird

Eine Definition eines Antioxidans ist „jede Substanz, die oxidative Schäden an einem Zielmolekül verzögert, verhindert oder beseitigt“1. Es gibt kein allgemeingültiges „bestes“ Antioxidans: Verschiedene Antioxidantien reagieren unterschiedlich schnell mit unterschiedlichen ROS, wirken an verschiedenen Orten und schützen unterschiedliche molekulare Ziele. Eine alternative Definition ist „eine Substanz, die mit einem Oxidationsmittel reagiert, um dessen Reaktionen mit anderen Zielen zu regulieren und so redoxabhängige biologische Signalwege und/oder oxidative Schäden zu beeinflussen“.

Oxidativer Schaden: der biomolekulare Schaden, der durch den Angriff von ROS auf die Bestandteile lebender Organismen verursacht wird. Ein erhöhtes Maß an oxidativem Schaden kann durch eine erhöhte ROS-Produktion, aber auch durch verminderte Reparatur- oder Entfernungsprozesse entstehen – zum Beispiel durch das Versäumnis, oxidierte Proteine ​​schnell genug zu beseitigen oder oxidierte DNA zu reparieren: Beides kann bei bestimmten Krankheiten auftreten.

Biomarker: kann als jede Substanz, Struktur oder jeder Prozess definiert werden, der im Körper oder seinen Produkten gemessen werden kann und das Auftreten von Ergebnissen oder Krankheiten beeinflusst oder vorhersagt54.

Ein Problem, das der Messung von ROS und oxidativem Schaden sowie der Verwendung von „Antioxidantien“ zugrunde liegt, ist die mangelnde Präzision bei der Verwendung dieser Begriffe. ROS ist eine Abkürzung, die ein breites Spektrum chemischer Spezies mit unterschiedlichen Eigenschaften, Reaktivitäten und Wechselwirkungen abdeckt (Kasten 1, Tabelle 1). Beispielsweise entsteht eine wichtige reaktive Spezies in der Biologie, das Superoxidradikalanion (O2•−), durch die Ein-Elektronen-Reduktion von Sauerstoff (O2). An sich ist O2•− nicht sehr reaktiv, außer mit einem anderen radikalischen Stickoxid (•NO) unter Bildung von Peroxynitrit11 oder mit Fe-S-Clustern in Proteinen12. Ebenso ist Wasserstoffperoxid (H2O2), das von verschiedenen Oxidaseenzymen1,4 und durch die Wirkung von Superoxiddismutase (SOD) gebildet wird, schwach reaktiv, was seine Verwendung als wichtiges Signalmolekül in vivo ermöglicht2,4. Dennoch bildet H2O2 in Gegenwart von Eisen- oder Kupferionen das äußerst reaktive Hydroxylradikal (•OH) nach Fenton-Chemie: •OH reagiert unspezifisch und im Wesentlichen augenblicklich mit jedem in der Nähe befindlichen Biomolekül (Tabelle 1)1,13. Die Verfügbarkeit von Übergangsmetallionen zur Katalyse der Fenton-Chemie wird in vivo1 sorgfältig kontrolliert, diese können jedoch durch Gewebeverletzungen oder wenn bestimmte Proteine ​​mit Fe-S-Clustern auf O2·− treffen (Lit. 1,12,14) freigesetzt werden. Ihre Bedeutung in vivo wurde kürzlich durch die wachsende Literatur über Ferroptose, eine Form des Zelltods, an der „katalytische“ Eisenionen beteiligt sind, unterstrichen15. H2O2 ist ein Substrat für Hämperoxidasen wie Myeloperoxidase und erzeugt weitere reaktive Spezies wie HOCl (Tabelle 1). Trotz seiner geringen Gesamtreaktivität kann H2O2 einige Methionin- (Met) und Cysteinreste (Cys)16,17 in bestimmten Proteinen selektiv oxidieren.

Eine (bei weitem nicht vollständige) Liste der physikochemischen Eigenschaften der in der Biologie am häufigsten vorkommenden ROS ist in Tabelle 1 aufgeführt. Sie gibt Aufschluss darüber, welche Reaktionen in vivo bei der Erzeugung dieser Arten plausibel sein könnten. Es sollte auch klar sein, dass „reaktiv“ stark vom Kontext abhängt, da die Reaktivität verschiedener ROS über einen weiten Maßstab variiert, ebenso wie ihre Lebensdauer, ihre Fähigkeit zur Diffusion und ihr Potenzial zur Erzeugung weiterer stromabwärts gelegener reaktiver Spezies. Kurz gesagt: Nicht alle ROS sind gleich. Obwohl die Verallgemeinerung „ROS“ weit verbreitet ist (auch in diesem Artikel!), gibt sie keine Auskunft über die tatsächliche chemische Spezies, die den beobachteten Effekt verursacht. Empfehlung 1: Wo immer möglich, sollten die tatsächlich an einem biologischen Prozess beteiligten chemischen Spezies angegeben und berücksichtigt werden, ob der beobachtete Effekt mit seiner Reaktivität, Lebensdauer, erzeugten Produkten und seinem Verbleib in vivo vereinbar ist. Wenn dies nicht möglich ist, sollten Vorbehalte bezüglich der Verwendung des Begriffs „ROS“ besprochen werden.

In der Biologie gibt es ein breites Spektrum an Antioxidantien. Dazu gehören Enzyme und kleine Moleküle, die mit einzelnen ROS reagieren, um oxidative Schäden zu verringern und/oder die Redox-Signalisierung zu modulieren1,2. Wie bei „ROS“ kann die Verwendung von „Antioxidans“ als allgemeiner Begriff ungenau und irreführend sein (Kasten 1). Oft wird die Wirkung eines mutmaßlichen Antioxidans auf ein biologisches Ergebnis herangezogen, um auf eine Rolle eines ROS zu schließen, als ob alle Antioxidantien gleichwertig wären. Allerdings hat jedes Antioxidans seine eigene spezifische Chemie und Reaktivität mit unterschiedlichen ROS. Darüber hinaus sind die wichtigsten Antioxidantien in vivo enzymatische Systeme wie SOD für O2•−, Peroxidasen für H2O2 und Metallionen-Sequestrierung1,14. Die meisten niedermolekularen Verbindungen, die üblicherweise als „Antioxidantien“ eingesetzt werden, sind stöchiometrische Fänger bestimmter ROS und weisen oft (wenn überhaupt) eine mäßige Reaktivität mit O2•− oder H2O2 auf. Beispielsweise ist N-Acetylcystein (NAC) ein weit verbreitetes „Antioxidans“, hat jedoch andere (und manchmal wichtigere18) Wirkungsweisen. NAC kann tatsächlich einige ROS in vitro abfangen, andere jedoch nicht, insbesondere nicht H2O2 (Lit. 18). Es kann auch den zellulären Cys-Pool erhöhen und dadurch den Glutathionspiegel (GSH) erhöhen, H2S erzeugen und Proteindisulfide direkt spalten18. Zu den niedermolekularen Verbindungen, die in vivo tatsächlich als Antioxidantien wirken, gehört Vitamin E, das Lipidperoxylradikale abfängt19. Manchmal werden „OH-Fänger“ verwendet, um eine Rolle für diese ROS abzuleiten, doch sie können selten, wenn überhaupt, eine ausreichend hohe Konzentration erreichen, um die praktisch sofortige Reaktion von •OH mit Biomolekülen zu verhindern1,7,13. Folglich sind viele der biologischen Wirkungen, die „Antioxidantien“, insbesondere NAC, zugeschrieben werden, auf andere Wirkungen zurückzuführen. Andere Wirkstoffe, die oft als „Antioxidantien“ verwendet werden, wie TEMPO/TEMPOL, Mito-TEMPO und Porphyrin-basierte „SOD-Mimetika“, unterliegen in vivo komplexen Redoxreaktionen und werden besser als „Redoxmodulatoren“ statt als „Antioxidantien“ oder „O2“ beschrieben •− Aasfresser'1,20,21. Empfehlung 2: Damit eine Intervention auf eine antioxidative Aktivität zurückgeführt werden kann, muss die bestimmte chemische Spezies, auf die das „Antioxidans“ abzielt, explizit angegeben werden. Es sollte berücksichtigt werden, dass es unwahrscheinlich ist, dass niedermolekulare „Antioxidantien“ durch das Abfangen von H2O2 wirken. Die Spezifität, Geschwindigkeitskonstante, Lage und Konzentration des Antioxidans innerhalb der Zelle sollten eine antioxidative Wirkung chemisch plausibel machen. Wo immer möglich, sollte die Aktivität des Antioxidans durch Messung einer Verringerung des oxidativen Schadens bestätigt werden.

Ein Schlüsselverfahren zur Zuordnung oxidativer Schäden oder der Aktivierung eines Redox-Signalwegs zu einem bestimmten ROS kann die selektive Erzeugung des ROS in einem biologischen Kontext sein. Dies kann durch die Verwendung von Redox-Cycling-Verbindungen wie Paraquat (PQ) oder Chinonen zur Erzeugung von O2•− oder MitoPQ zur Erzeugung von O2•− in den Mitochondrien erreicht werden1,22. Natürlich wird eine erhöhte O2•−-Erzeugung auch die H2O2-Produktion durch O2•−-Dismutation erhöhen. Glukoseoxidase kann verwendet werden, um H2O2 direkt in vitro zu erzeugen, während die regulierte Erzeugung von H2O2 in Zellen mithilfe genetisch exprimierter D-Aminosäureoxidase erreicht werden kann, einem Enzym, das H2O2 erzeugt, während es D-Aminosäuren oxidiert23. Es kann gezielt an verschiedene Stellen in der Zelle gelangen und der Fluss kann durch Variation der hinzugefügten Konzentration seines Substrats D-Alanin reguliert werden23. NADPH-Oxidase (NOX)-Enzyme sind wichtige Quellen von O2·− und H2O2 für die Redoxsignalisierung sowie für oxidative Schäden9,24, und die Modulation ihrer Aktivität ist ein wichtiger Ansatz zum Verständnis dieser Prozesse. Es wurde eine Reihe ziemlich spezifischer Inhibitoren von NOX-Enzymen beschrieben24. Allerdings ist die Verwendung von Verbindungen wie Apocynin und Diphenyleniodonium als „NOX-Inhibitoren“ immer noch weit verbreitet, auch wenn ihre mangelnde Spezifität gut belegt ist1,24. Empfehlung 3: Wir empfehlen die Verwendung von PQ, Chinonen und MitoPQ zur selektiven Erzeugung von O2•− und die zelluläre Expression von d-Aminosäureoxidase zur kontrollierten Erzeugung von H2O2. Vermeiden Sie die Hemmung eines Phänomens durch Apocynin oder Diphenyleniodonium als alleinigen Beweis für eine Rolle von NOX-Enzymen oder diskutieren Sie zumindest deren mangelnde Spezifität. Spezifische Inhibitoren24 oder die Löschung oder Beseitigung von NOX-Komponenten sollten verwendet werden, um ihre Rolle zu identifizieren.

Bei der Untersuchung von ROS in biologischen Systemen ist es wichtig, die interessierenden ROS zu erkennen und zu quantifizieren. Dies kann mithilfe der paramagnetischen Elektronenresonanz (EPR/ESR), verschiedener Sondenmoleküle oder durch Messung oxidativer Modifikationen („oxidativer Schaden“, Kasten 1), die durch ROS1 verursacht werden, erfolgen. Die meisten ROS-Sonden erfassen nur einen kleinen Prozentsatz der gebildeten ROS. Tatsächlich würde eine Reaktion der Sonde mit dem Großteil der erzeugten ROS das System stören und die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen (z. B. Hemmung oxidativer Schäden oder Störung der Redox-Signalübertragung). Es ist jedoch wichtig, dass die prozentuale Erfassung über verschiedene Produktionsraten der betreffenden ROS annähernd konstant bleibt.

Oxidativer Schaden kann viele Formen annehmen; Die chemischen Prozesse, durch die es aus einem bestimmten ROS entsteht, und die Art und Weise, wie es bewertet und quantifiziert wird, sind komplex. Darüber hinaus ist der endgültige Wert eines gemessenen Biomarkers für oxidative Schäden die Differenz zwischen seiner Produktionsrate und seiner Entfernung durch Reparatur, Abbau, Ausscheidung oder Diffusion. Empfehlung 4: Wenn das Ausmaß der oxidativen Schädigung eines Biomoleküls angegeben wird, sollten die chemischen Prozesse, durch die sie entstehen, und die Methoden, die zu ihrer Quantifizierung verwendet werden, explizit dargelegt werden. Die Auswirkungen von Reparaturen und Räumungen auf die endgültig gemessenen Werte sollten berücksichtigt und diskutiert werden.

Die Betrachtung von ROS, Antioxidantien und oxidativem Schaden als monolithische Konzepte schränkt die Präzision und Interpretation von Experimenten ein und verschweigt die Notwendigkeit, präzise molekulare Mechanismen zu etablieren. Um diese Grundsätze in die Praxis umzusetzen, ist die Messung spezifischer ROS und/oder oxidativer Schadensprodukte sowie der Wirkung von Antioxidantien erforderlich. Dies stellt eine große praktische Herausforderung dar, da die meisten ROS nur von kurzer Dauer sind (Lebensspanne von Millisekunden oder weniger) und ihre Steady-State-Werte niedrig sind (pikomolar bis niedrig mikromolar) und sich schnell ändern, da sie durch kontinuierlich variierende chemische Erzeugungsraten beeinflusst werden Reaktion und Diffusion.

In einfachen In-vitro-Systemen ist es möglich, mehrere ROS nachzuweisen (Tabelle 2). Beispielsweise kann die O2·−-Produktion durch die Reduktion von Cytochrom c überwacht und ihre Selektivität durch Hemmung durch zugesetztes SOD beurteilt werden. Allerdings kann selbst ein so „einfaches“ System überraschend komplex sein. Beispielsweise können Semichinone Cytochrom c in einer durch SOD25 gehemmten Reaktion reduzieren. Das Fazit ist, dass alle Methoden zur Bestimmung von ROS anfällig für Artefakte sind und dass geeignete Kontrollen erforderlich sind, um die gemessenen Arten und Mengen sicher zu stellen. Daher ist es wichtig, Messungen mit „orthogonalen Techniken“ zu bestätigen, die auf einem alternativen Ansatz mit einer anderen Nachweismethode basieren, um methodenspezifische Artefakte zu vermeiden. Diese Komplexität wird noch größer, wenn man versucht, ROS in Zellen zu messen. Häufig verwendete Zellkulturbedingungen fördern oxidative Schäden aufgrund der begrenzten Antioxidantien im Medium und der hohen O2-Konzentrationen im Vergleich zu denen in vivo26. Folglich erzeugen kultivierte Zellen mehr ROS, als diese Zellen es in vivo tun würden.

Empfehlung 5: Verwenden Sie kommerzielle Kits nur, wenn die tatsächlich zu messende Spezies und die Nachweismethode im Kit-Material erläutert werden, chemisch plausibel sind und die Einschränkungen verstanden werden. Von der Verwendung kommerzieller Kits ohne solche Informationen wird dringend abgeraten. Um methodenspezifische Artefakte zu vermeiden, bestätigen Sie die Ergebnisse mit Techniken, die auf unterschiedlichen Erkennungsprinzipien basieren.

Zur Beurteilung der ROS in Zellen werden häufig niedermolekulare Fluoreszenzsonden eingesetzt. In einigen Fällen, oft bei Kits, erschwert die fehlende Beschreibung der chemischen Reaktivität oder Struktur dieser Sonden die Interpretation der Ergebnisse und daher sollten solche Sonden vermieden werden. Selbst bei Sonden mit bekannter Struktur können Bedenken bestehen. Betrachten Sie die weit verbreitete Fluoreszenzsonde 2',7'-Dichlordihydrofluorescein (DCFH), die üblicherweise in ihrer Diacetatform (DCFH-DA) verabreicht wird und leicht in die Zellen eindringt. DCFH wird von mehreren ROS zum fluoreszierenden Produkt 2',7'-Dichlorfluorescein (DCF) oxidiert und ist daher nicht spezifisch für ein bestimmtes ROS6,7. DCFH wird nicht direkt durch H2O2 oxidiert (was oft behauptet wird), sondern erst, nachdem H2O2 durch redoxaktive Metalle oder durch Hämproteine ​​wie Cytochrom C oder Peroxidasen in reaktivere Spezies umgewandelt wurde. Darüber hinaus reagieren die Oxidation von DCFH und die Fluoreszenz von DCF empfindlich auf lokale O2-Werte und den pH-Wert, und die Fluoreszenzausbeute ist möglicherweise nicht linear mit erhöhten ROS-Werten27,28,29. Dies bedeutet nicht, dass DCFH und andere unspezifische Fluoreszenzsonden wie Dihydrorhodamin niemals verwendet werden sollten, aber ihre Einschränkungen (Selektivität, Quantifizierungsprobleme, Linearität der Reaktion und Anfälligkeit für Artefakte) sollten verstanden und die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden28. Insbesondere sollte ihre Reaktion nicht ohne detaillierte Kontrollen zur Validierung einem bestimmten ROS zugeordnet werden, und ihre Verwendung sollte auf eine anfängliche Bewertung einer Änderung des zellulären Redoxzustands beschränkt werden, gefolgt von einer detaillierteren Untersuchung des Mechanismus. Während viele Fluoreszenzsonden für kleine Moleküle und Proteine ​​selektiver sind als DCF, ist es immer wichtig, Daten durch eine Reihe einfacher Kontrollen zu validieren: Ändert sich die Reaktion im Laufe der Zeit und mit der Menge der biologischen Probe auf plausible Weise? Kann der Effekt durch die Erzeugung der gewünschten ROS repliziert werden (z. B. durch Verwendung von PQ für O2•− oder d-Aminosäureoxidase für H2O2)? Reagieren Negativkontrollen, die den ROS-erzeugenden Prozess abschaffen sollten (z. B. Gen-Knockouts, Knockdowns, Inhibitoren, Radikalfänger), wie erwartet? Empfehlung 6: Bei der Verwendung von fluoreszierenden ROS-Sonden (insbesondere DCFH-DA) sollten die beteiligte Chemie, die Selektivität für bestimmte chemische Spezies und potenzielle Artefakte klargestellt und diskutiert werden. Wo immer möglich, sollten Kontrollen durchgeführt werden, um zu zeigen, dass die Reaktion auf die vorgeschlagene Art zurückzuführen ist, und orthogonale Techniken zur Bestätigung der Schlussfolgerung eingesetzt werden.

Die Ausweitung der ROS-Messungen von Zellen in Kultur auf Gewebe in vivo oder ex vivo ist von entscheidender Bedeutung. In einigen Fällen wurde diese Lücke jedoch durch die Zugabe von „ROS-Sonden“ zu frischen oder zuvor gefrorenen Gewebeschnitten oder Homogenaten ex vivo geschlossen. Diese Messungen können bedeutungslos sein, da die sehr kurze Lebensdauer von ROS bedeutet, dass alle in vivo vorhandenen ROS zum Zeitpunkt der Untersuchung des Materials längst verschwunden sein werden. Darüber hinaus werden durch das Einfrieren oder Homogenisieren Membranen zerstört und Substrat- und Ionenkonzentrationen verändert (z. B. Erhöhung des Ca2+- oder „katalytischen“ Fe2+-Spiegels)1, sodass jegliche ROS-Produktion im Gewebeschnitt oder Homogenat in keinem Zusammenhang mit den Spiegeln steht, die erreicht worden wären in vivo erzeugt. Es stehen gültige Methoden zur Verfügung, um ROS in vivo oder in perfundierten Organen zu bestimmen. In diesen Situationen wird der Prozess jedoch entweder in vivo überwacht (siehe beispielsweise Tabelle 2 für die Verwendung der Katalaseverbindung I zur Messung von H2O2) oder das System wird gequencht Stabilisieren Sie die Sonde für die Analyse ex vivo. Empfehlung 7: Messungen von ROS sollten in Zellen, Geweben oder Organen unter physiologisch relevanten Bedingungen in vivo oder ex vivo durchgeführt werden. ROS sollten nicht in Gewebehomogenaten oder Kryoschnitten „gemessen“ werden, es sei denn, die verwendete Sonde oder der verwendete Sensor ist in der Lage, die reaktiven Spezies irreversibel einzufangen, wenn sich die Zellen/Gewebe/Organe unter biologisch relevanten Bedingungen befinden.

Hier skizzieren wir die unserer Meinung nach derzeit besten Ansätze zur Messung häufig vorkommender ROS.

In einfachen Systemen kann O2•− auf verschiedene Arten gemessen werden, beispielsweise durch die SOD-hemmbare Reduktion von Cytochrom c (Lit. 25). Die Erzeugung von O2•− kann auch durch Spin-Trapping und anschließende EPR beurteilt werden, was den Vorteil einer direkten Detektion des Radikals1 bietet. Der Fe-S-Cluster in Aconitase wird durch O2•− und andere ROS inaktiviert, aber seine Wechselwirkung mit O2•− ist schnell, einigermaßen spezifisch und reversibel, was ihn zu einem guten Indikator für O2•− in Mitochondrien macht30. Die chemilumineszierenden „Superoxidsonden“ Luminol und Lucigenin werden häufig zum „Nachweis von O2•−“ verwendet, aber die Interpretation solcher Daten ist schwierig, da diese Sonden Radikale erzeugen, die selbst O2•− produzieren; Sie reagieren nicht direkt mit O2•−31,32.

Empfehlung 8: Von der Verwendung von Luminol und Lucigenin zum „Nachweis von O2•−“ sollte abgeraten werden, sie können jedoch als allgemeine Indikatoren für eine erhöhte ROS-Produktion verwendet werden. Bessere Strategien sind die SOD-empfindliche Reduktion von Cytochrom C in vitro und die Inaktivierung der Aconitase in den Mitochondrien.

In Zellen wird O2•− häufig durch Messung der Fluoreszenz nachgewiesen, die bei der Oxidation von Dihydroethidium (manchmal auch Hydroethidin (HE) genannt) oder auf Mitochondrien gerichtetes HE (MitoSOX) entsteht. Leider ist der Fluoreszenznachweis irreführend, da diese Sonden sowohl Ethidium (E+), ein unspezifisches Oxidationsprodukt, als auch das O2·−-spezifische Produkt 2-Hydroxyethidium bilden. Da diese beiden Produkte überlappende Fluoreszenzspektren aufweisen, ist es schwierig, den Beitrag der unspezifischen Oxidation und der O2·−-abhängigen Oxidation (falls vorhanden) zur Gesamtfluoreszenz zu unterscheiden33. Eine genaue Quantifizierung des 2-Hydroxyethidium-Produkts kann mithilfe der Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS)33 erreicht werden. Ein weiterer Faktor, der berücksichtigt werden sollte, ist das Ausmaß der zellulären Aufnahme von HE/MitoSOX und die intrazellulären Konzentrationen dieser und ihrer vielfältigen Produkte. Darüber hinaus interkalieren HE-Oxidationsprodukte in die DNA, verstärken deren Fluoreszenz erheblich und erzeugen ein weiteres Artefakt. NeoD und MitoNeoD enthalten ein modifiziertes HE, das nicht in DNA interkaliert34.

Mitochondrial akkumulierte O2•−-Sonden wie MitoSOX werden häufig zum „Nachweisen von O2•−“ in Mitochondrien verwendet. Bei der Verwendung dieser und anderer Sonden, die positive Ladungen haben oder positiv geladene Spezies erzeugen (einschließlich 2-Hydroxyethidium und Ethidium), ist es wichtig zu bedenken, dass die Sondenakkumulation von Plasma- und Mitochondrienmembranpotentialen sowie der Größe, Form und Masse der Mitochondrien abhängt35. Darüber hinaus kann die Fluoreszenz gelöscht werden, wenn diese in hohen Konzentrationen in den Mitochondrien vorhanden sind36.

Empfehlung 9: Verwenden Sie zum Nachweis von O2•− durch einfache Fluoreszenzmessungen nur HE- oder MitoSOX-Sonden, wenn das Produkt unabhängig als 2-Hydroxyethidium validiert wurde. Fluoreszenzmessungen mit Sonden wie Dihydroethidium und MitoSOX33 sollten mit der niedrigstmöglichen Sondenkonzentration durchgeführt werden und müssen Kontrollen für Änderungen der Plasma- und Mitochondrienmembranpotentiale sowie der Mitochondrienmasse und -morphologie umfassen, wie z. B. die Normalisierung auf ein ähnliches Membranpotential-responsives, aber redoxunempfindlich, Sonde. Nach Möglichkeit sollten LC-MS-Methoden durchgeführt werden, die alle modifizierten Spezies33 messen.

In einfachen Systemen kann H2O2 durch Meerrettichperoxidase (HRP) oxidierende Substrate gemessen werden, wobei Amplex Red häufig verwendet wird. Diese Methoden können durch andere HRP-Substrate (z. B. Ascorbat und NAC)1 und durch O2•− (das HRP inaktivieren kann) beeinträchtigt werden, wobei letzteres durch die Zugabe von SOD37 verhindert werden kann. Da H2O2 Membranen direkt oder über Aquaporine passieren kann, kann dieses System auch zur Messung der H2O2-Freisetzung aus Zellen verwendet werden. Bitte beachten Sie jedoch, dass diese Freisetzung das Gleichgewicht zwischen der H2O2-Produktion, der Entfernung durch intrazelluläre Enzyme und der Diffusionsrate aus der Zelle widerspiegelt.

Innerhalb von Zellen ist der H2O2-Nachweis durch Phenylboronat-basierte Sonden zuverlässiger38, obwohl diese möglicherweise nicht ausreichend empfindlich sind, da sie nur langsam mit H2O2 reagieren, was es schwierig machen kann, kleine oder lokalisierte Änderungen im H2O2-Spiegel zu erkennen39. Jüngste Studien deuten jedoch darauf hin, dass Borinsäuren, die schneller mit H2O2 reagieren, möglicherweise empfindlichere Detektoren sind40. Der Mechanismus der Oxidation von Phenylboronaten zu Phenolen erfordert ein Zwei-Elektronen-Oxidationsmittel wie H2O2. Da H2O2 typischerweise in höheren Konzentrationen erzeugt wird als andere ROS, können Boronatsonden bei ordnungsgemäßer Kontrolle selektiv für den H2O2-Nachweis sein39,40. Allerdings reagieren Boronatsonden mit ONOO−/ONOOH oder HOCl viel schneller als mit H2O2, was manchmal Messungen erschweren kann, und orthogonale Ansätze oder die Verwendung von Inhibitoren können die Validierung unterstützen41. Beispielsweise können H2O2- und Peroxynitrit-abhängige Signale mithilfe von Stickoxidsynthase (NOS)-Inhibitoren und Katalase unterschieden werden38,39,41,42.

Genetisch kodierte Fluoreszenzproteinsensoren haben zu großen Fortschritten bei der zellulären H2O2-Detektion geführt43,44,45,46. Diese Sonden enthalten einen Dithiol-Schalter, der die Gesamtfluoreszenz der Sonde abhängig von ihrem Oxidationsstatus verändert. Eine hohe Sensitivität und Spezifität für H2O2 wurde durch die Kopplung einer Redox-sensitiven Mutante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) an ein H2O2-sensitives Thiolprotein wie OxyR (HyPer-Serie) oder an eine Peroxidase wie Orp1 oder TSA2 (roGFP2-) erreicht. basierende Sonden). HyPer7 und roGFP2 gekoppelt an ein Peroxiredoxin bieten die höchste Empfindlichkeit44,45. Während HyPer7- und roGFP2-basierte Sonden pH-stabil sind, sind frühere Versionen von HyPer nicht pH-stabil und erfordern die Expression einer Kontrollsonde (SypHer), um Signaländerungen aufgrund von pH-43-Schwankungen zu kontrollieren. Normalerweise wird eine bildgebende Analyse mittels Fluoreszenzmikroskopie durchgeführt, es können jedoch auch Fluoreszenzplattenlesegeräte verwendet werden. Der gemessene Redoxstatus stellt ein Gleichgewicht zwischen der Oxidationsrate und der erneuten Reduktion der Sonden durch zelluläre Reduktionsmittel, einschließlich Glutaredoxin/GSH und Thioredoxin, dar und ermöglicht Echtzeitbewertungen des Redoxstatus an lebenden Zellen. Da Anregungswellenlängen sowohl reduzierter als auch oxidierter Sonden verwendet werden, sind die Sonden ratiometrisch und die Ausgabe hängt nicht vom Grad der Proteinsondenexpression ab. Durch den Einbau geeigneter Targeting-Gensequenzen können diese Sonden auf verschiedene Zellkompartimente gerichtet werden, darunter Mitochondrien, Mikrotubuli, endoplasmatisches Retikulum, Zellkern und Zytoplasma43,44,45,46. Daher können subzelluläre Regionen von Interesse untersucht und die Sonde dann am Ende durch vollständige Reduktion (2 mM Dithiothreitol), Auswaschen und vollständige Oxidation (2 mM t-Butylhydroperoxid) kalibriert werden44,45. Diese Kalibrierung liefert ein Maß für den Oxidationsprozentsatz und ermöglicht Vergleiche zwischen Experimenten und zwischen subzellulären Kompartimenten44,45. Diese Sonden wurden in transgenen Tieren exprimiert, um nützliche Bewertungen der H2O2-Generationen in vivo zu ermöglichen46,47. Die Plasmidtransfektion viraler Vektoren kann mit kultivierten Zellen verwendet werden, und gezielte roGFP2-Sonden sind im Handel erhältlich (www.addgene.com).

In den meisten Experimenten werden die H2O2-Sonden als freie Proteine ​​ausgedrückt, die sich innerhalb der Zelle verteilen. Angesichts der Unsicherheiten über die intrazellulären H2O2-Diffusionsabstände ist jedoch immer noch unklar, welche Auflösung erforderlich ist, um die subzelluläre H2O2-Verteilung zu verstehen. Daher ist die Anbindung von H2O2-Sonden an Subkompartimentstellen wie Proteinkomplexen oder Organellenkontaktstellen ein wichtiger Ansatz.

Empfehlung 10: Genetisch kodierte Fluoreszenzsonden (von denen einige im Handel erhältlich sind) sind derzeit die empfindlichsten Detektoren für H2O2 und wir empfehlen ihren Einsatz in Zellen und Tieren, sofern eine Expression möglich ist. Boronatsonden (von denen einige auch im Handel erhältlich sind) sind die bevorzugten Sonden für kleine Moleküle, es sind jedoch Kontrollen zur Bestimmung der Spezifität für H2O2 erforderlich und die Empfindlichkeit ist für physiologische H2O2-Spiegel begrenzt. Amplex Red mit HRP kann die H2O2-Freisetzung aus Zellen messen, wenn andere Reduktionsmittel oder Peroxidasesubstrate fehlen.

Peroxynitrit (ONOO−) weist eine komplexe Chemie auf42,48,49 und kann selbst bestimmte Biomoleküle oxidieren. Eine wichtige physiologische Reaktion findet mit CO2 statt (Tabelle 1), und daher spielt der CO2/\({{{\mathrm{HCO}}}}_3^{- }\)-Gehalt biologischer Systeme eine Rolle bei der Bestimmung der biologischen Auswirkungen50 von ONOO−. Zu den Produkten dieser Reaktion gehören reaktive Spezies wie das Carbonatanion (CO3•−) und das Nitrierungsmittel Stickstoffdioxid (NO2•) (Tabelle 1), die beide mit vielen der allgemeinen „ROS-Sonden“ reagieren. Peroxynitrit oxidiert Boronat-basierte Sonden fast eine Million Mal schneller als H2O2 und unter den richtigen Bedingungen können diese Sonden zur Beurteilung der ONOO−/ONOOH-Produktion verwendet werden42,49. Peroxynitrit wurde in Geweben ex vivo mithilfe von Boronat-Sonden gemessen51.

HOCl, hypobromige Säure (HOBr) und einige der daraus abgeleiteten Chloramine und Bromamine (Tabelle 1) reagieren mit den meisten allgemeinen Sonden zum Nachweis von ROS, einschließlich DCFH und Luminol. Allerdings sind viele dieser Sonden auch Substrate der Peroxidasen, die HOCl oder HOBr erzeugen, was ihre Verwendung erschwert. Es wurde über spezifischere Fluoreszenzsonden für reaktive Halogenspezies berichtet, von denen einige im Handel erhältlich sind52. Es wurde eine genetisch kodierte Sonde für reaktive Halogenspezies entwickelt, die eine dynamische Überwachung dieser Spezies sowohl in Zellkultur als auch in vivo ermöglicht53.

Das Vorhandensein von ROS lässt sich anhand ihrer Wirkung auf Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und Lipide ableiten, um spezifische Verbindungen zu erzeugen, die, solange sie nicht durch andere Mechanismen gebildet werden können, als „Biomarker“ für oxidative Schäden verwendet werden können (Kasten 1). 1,54,55. Beachten Sie jedoch, dass die gemessenen Biomarkerspiegel ein Gleichgewicht zwischen der Erzeugung und Entfernung des Biomarkers (z. B. durch Abbau, Diffusion oder Ausscheidung) sowie etwaigen künstlich erhöhten Werten darstellen, die durch oxidative Schäden während der Isolierung oder Analyse verursacht werden.

Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) werden leicht oxidiert, weshalb Lipidperoxidationsprodukte häufig zur Charakterisierung oxidativer Schäden verwendet werden56,57,58. Die Lipidperoxidation kann durch bestimmte ROS initiiert werden und als zufälliger, nicht-enzymatischer (oft kettenförmiger) radikalischer Prozess ablaufen. Es stehen jedoch auch enzymatische Mechanismen (z. B. Lipoxygenasen) für die Peroxidation freier PUFAs oder PUFA-Phospholipide zur Verfügung, die spezifische Signalprodukte mit biologischen Funktionen produzieren. Daher könnte bei der Messung der Lipidperoxidation der Schwerpunkt entweder auf (1) der Feststellung einer erhöhten Lipidperoxidation als Beispiel für oxidative Schäden oder (2) der Identifizierung einzelner oxidativ veränderter Lipidmoleküle liegen, die durch selektive Interaktion mit bestimmten zellulären Zielen als Signale wirken.

In PUFAs macht das Vorhandensein einer Doppelbindung neben einer Methylengruppe die Methylen-CH-Bindung schwächer und daher ist der bis-allylische Wasserstoff anfälliger für die H•-Abstraktion56,57,58. Das durch die H•-Abstraktion erzeugte kohlenstoffzentrierte Radikal (L) wird durch Delokalisierung über die Doppelbindungen stabilisiert. Die anschließende Reaktion mit O2 ergibt ein Peroxylradikal (LOO) unter Bildung eines konjugierten Diensystems und einer Reihe von Peroxiden (LOOH). LOO• kann weiter reagieren, um stark oxidierte Sekundärprodukte zu ergeben, darunter Epoxid-, Oxo- oder zyklische Peroxide56,57,58. Daher gibt es mehrere Endprodukte der Lipidperoxidation, die eine große chemische Heterogenität sowie variable Stabilität und Polarität aufweisen, und daher stellt die Messung nur eines einzigen Oxidationsprodukts keineswegs den gesamten Prozess der Lipidperoxidation dar.

Zur Beurteilung der „allgemeinen“ Lipidperoxidation stehen mehrere Methoden zur Verfügung. In einfachen Modellsystemen (z. B. isolierten Lipoproteinen) kann die Dienkonjugation durch die Absorption von ultraviolettem (UV) gemessen werden. Diese Methode ist jedoch nicht für den Einsatz in Zellen oder Körperflüssigkeiten geeignet, da störende UV-absorbierende Moleküle vorhanden sind, die nicht zur Folge haben durch Lipidperoxidation1. In Zellen kann die „Lipidperoxidation“ durch Veränderungen in der Fluoreszenz von BODIPY beurteilt werden, das an eine peroxidationsempfindliche Undecansäure-Einheit konjugiert ist59. Dieser Test ist technisch einfach, sollte aber mit Vorsicht interpretiert werden, da die Reaktionsgeschwindigkeit von BODIPY mit Peroxylradikalen langsamer ist als die von radikalfangenden Antioxidantien und daher muss die Unterdrückung der BODIPY-Fluoreszenz durch Antioxidantien nicht immer deren Fähigkeit widerspiegeln, die Lipidperoxidation zu unterdrücken59. Ein weiterer fluorometrischer Test zur Lipidperoxidation verwendet cis-Parinarsäure (PnA), eine Fettsäure mit vier konjugierten Doppelbindungen. Die Oxidation von PnA stört sein konjugiertes System und damit die Fluoreszenz. Da PnA in verschiedene Klassen von Phospholipiden eingebaut werden kann, liefert die Trennung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) Informationen über die Oxidation verschiedener Phospholipide60. Die Extrapolation PnA-basierter Ergebnisse auf die endogene Phospholipidoxidation ist jedoch aufgrund der höheren Oxidationsrate von PnA, seiner Anfälligkeit für Photobleichung und dem unterschiedlichen metabolischen Einbau von PnA in verschiedene Phospholipide schwierig60.

Die Lipidperoxidation wird häufig durch die Messung von Endprodukten wie α,β-ungesättigten Hydroxyalkenalen61 beurteilt, idealerweise durch MS-basierte Techniken. Insbesondere die Bildung von 4-Hydroxynonenal (HNE) ist weit verbreitet. Antikörper gegen die von HNE gebildeten Proteinaddukte sind weit verbreitet und werden häufig bei der Immunfärbung von Geweben verwendet. Es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass verschiedene Antikörper unterschiedliche Epitope erkennen und daher unterschiedliche Antworten geben können, je nachdem, an welche Aminosäurereste das HNE in Proteinen bindet61. 62,63,64.

Ein kleineres Endprodukt der Lipidperoxidation ist Malondialdehyd (MDA)61, das bei Messung mit MS-Techniken ebenfalls ein nützlicher Biomarker sein kann. Allerdings sind die weit verbreiteten „MDA-Assays“, die Thiobarbitursäure-reaktive Substanzen (TBARS) verwenden, unspezifisch, da TBA Chromogene aus vielen anderen Biomolekülen als MDA erzeugt1,65. Der Einsatz von HPLC zur Trennung des „echten“ TBA-MDA-Addukts von falschen Chromogenen erhöht die Spezifität, beseitigt jedoch nicht alle Probleme1.

Empfehlung 11: Die Anwendung des einfachen TBA-Tests (TBARS) oder darauf basierender Kits auf Zellen, Gewebe oder Körperflüssigkeiten wird nicht als einziger Test zur Bewertung oxidativer Lipidschäden empfohlen, da dies zu einer geringen Spezifität führen kann falsch positive Ergebnisse. HPLC-basierte TBA-Tests sind weniger anfällig für Artefakte.

Der Nachweis von Lipidoxidationsprodukten wurde durch die Entwicklung von LC-MS zur detaillierten Analyse oxidierter Lipidmischungen revolutioniert66. Die Sammlung und Lagerung von Proben zur Vermeidung einer künstlichen Peroxidation ist der Schlüssel zu jeder Lipidperoxidationsstudie, und Proben für eine spätere Analyse sollten sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren werden. Bioflüssigkeiten erfordern möglicherweise die Zugabe von Chemikalien (z. B. Butylhydroxytoluol), um eine Autooxidation während der Lagerung zu verhindern1,67. Die zur Quantifizierung verwendeten internen Standards sollten den Proben vor der Lösungsmittelextraktion zugesetzt werden. Solche LC-MS-basierten Methoden bieten den Vorteil einer hohen Empfindlichkeit, eines geringen Probenvolumenbedarfs und der Fähigkeit, mehrere Endprodukte der Lipidperoxidation nachzuweisen. Dies macht LC-MS-Protokolle zur Methode der Wahl für die Beurteilung der allgemeinen Lipidperoxidation und die Identifizierung einzelner Produkte, einschließlich solcher mit spezifischen Signalfunktionen. Allerdings können Einschränkungen der verfügbaren Standards manchmal eine quantitative Analyse bestimmter Produkte ausschließen. Bei solchen Studien ist eine sorgfältige Beachtung der Methodik erforderlich68.

Unter den Lipidoxidationsprodukten, die durch MS-basierte Ansätze quantifiziert wurden, sind die F2-Isoprostane (F2-IsoPs)69 hervorzuheben. 64 F2-IsoP-Stereoisomere können aus der durch freie Radikale induzierten, nicht-enzymatischen Oxidation von Arachidonsäure erzeugt werden und können von denen getrennt werden, die aus der enzymatischen Oxidation von Arachidonsäure durch Cyclooxygenase-Enzyme entstehen (COX-1/ -2). F3- und F4-Isoprostane entstehen aus Eicosapentaensäure (EPA) bzw. Docosahexaensäure (DHA), sind jedoch weniger gut charakterisiert als die F2-Isoprostane. ELISA-Methoden wurden entwickelt, um ein F2-IsoP-Isomer, 8-iso-PGF2α (auch als 15-F2t-IsoP oder iPF2α-III bezeichnet), zu quantifizieren und mit Gaschromatographie-MS und LC-Tandem-MS (LC-MS) zu vergleichen /MS) Methoden69,70,71,72,73. In all diesen Studien gab es eine schlechte Übereinstimmung zwischen kommerziell erhältlichen ELISA-Kits und MS-Methoden; 8-iso-PGF2α ist eines von 64 verschiedenen F2-IsoP-Isomeren, die bei der Peroxidation von Arachidonsäure entstehen, und die Antikörper-Kreuzreaktivität zwischen 8-iso-PGF2α und verwandten Isomeren ist eine Herausforderung. Die Probenreinigung vor der Analyse ermöglicht möglicherweise eine genauere Messung von 8-iso-PGF2α durch ELISA72,73, aber die mit Abstand genaueste Methode zur Quantifizierung von F2-IsoPs ist die LC-MS/MS und wird dringend empfohlen.

Empfehlung 12: F2-IsoPs sind ein allgemein anerkannter Biomarker der Lipidperoxidation, es sollte jedoch berücksichtigt werden, dass sie eines von vielen Endprodukten sind und dass die Konzentrationen verschiedener Typen durch experimentelle Bedingungen beeinflusst werden können69. Die Quantifizierung mittels ELISA ist anfällig für Artefakte, die Probenreinigung kann jedoch die Messung von 8-iso-PGF2α mittels ELISA ermöglichen73. LC-MS/MS mit geeigneten internen Standards ist der bevorzugte Ansatz.

Aminosäurereste in Proteinen reagieren empfindlich auf oxidative Veränderungen, von denen einige Formen nützliche Biomarker liefern74,75. Detaillierte Protokolle zur Messung mehrerer Produkte finden Sie in den Referenzen. 76,77. Eine häufige Proteinmodifikation ist die Bildung von „Proteincarbonylen“ aufgrund der Oxidation spezifischer Aminosäurereste zu Carbonylgruppen tragenden Produkten; Carbonyle können auch durch die Reaktion von Aldehyden mit nukleophilen Stellen auf Proteinen oder durch Glykierung gebildet werden75,77. Bei vielen Assays wird die Carbonylgruppe mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin derivatisiert, um ein Dinitrophenylhydrazon (DNP) zu bilden. Dieses Produkt kann spektrophotometrisch nachgewiesen werden, allerdings kann dieser Ansatz unter einem hohen Hintergrund und einer geringen Reproduzierbarkeit leiden; Um dies zu umgehen, können DNP-Addukte vor der Messung durch LC getrennt werden. Alternativ können Carbonyle mithilfe eines Antikörpers gegen DNP-Produkte mittels ELISA oder Immunoblot nachgewiesen werden78. Veränderungen der Proteincarbonyle können in mit Fluorescein-5-Thiosemicarbazid (FTC) behandelten Gewebehomogenaten gemessen werden, um Fluorophor-markierte Proteine ​​zu erzeugen, die durch Gelelektrophorese aufgetrennt werden können79. Es wurden Anreicherungsmethoden entwickelt, die eine mit Biotin markierte Derivatisierung in Verbindung mit einem LC-MS-Nachweis nutzen80. Proteincarbonyle, α-Aminoadipinsemialdehyd und Glutaminsemialdehyd wurden auch einzeln durch stabile Isotopenverdünnungsanalyse LC-MS/MS77 untersucht. Natürlich spiegeln Daten zu einem einzelnen Zeitpunkt den Unterschied zwischen den Bildungs- und Entfernungsraten (z. B. durch Reparatur oder Proteolyse) dieser Produkte wider.

Die Proteinanalyse mittels MS ermöglicht den Nachweis und die Identifizierung von Modifikationen mit charakteristischen Massenzunahmen (z. B. Hydroxylierung, Nitrierung und Chlorierung)75,76. Dies war besonders nützlich bei Studien zur oxidativen Schädigung von Gehirnproteinen bei Patienten mit Demenz durch „Redox-Proteomik“81. Die Kartierung auf Peptidebene nach der proteolytischen Spaltung ermöglicht die Erkennung der Art der Modifikation, ihrer Position innerhalb der Proteinsequenz und des damit einhergehenden Verlusts des Ausgangspeptids, was eine relative Quantifizierung ermöglicht. Die Aminosäureanalyse nach vollständiger Verdauung ermöglicht die Bestimmung der Arten und absoluten Konzentrationen bestimmter Arten (bestimmt durch die Verwendung isotopenmarkierter Standards) zusammen mit den Elternarten und ermöglicht so die Bestimmung einer „Massenbilanz“75,76,77,82. Bei der Probenhandhabung muss darauf geachtet werden, eine künstliche Oxidation von Cys oder Met zu verhindern, und auch während der Proteinhydrolyse, da einige Produkte der oxidativen Proteinschädigung labil sind. LC-MS-Analysen haben viele Vorteile, darunter hohe Spezifität, hohe Empfindlichkeit, die Fähigkeit, viele verschiedene Modifikationen und Elternspezies gleichzeitig zu erkennen, sowie die Fähigkeit, Produkte zu erkennen, die für die beteiligten ROS diagnostisch sind, wie z. B. Chlorierung aus HOCl83 und nitrierten Spezies entstehen durch die Wirkung von Myeloperoxidase in Gegenwart von NO2− und/oder durch Reaktionen von ONOO−/ONOOH49,84). Diese LC-MS-Ansätze können an Materialien durchgeführt werden, die von isolierten Proteinen bis hin zu Gewebeproben reichen. Die Quantifizierung relativ zu nicht modifizierten Aminosäuren oder Peptiden und vorzugsweise gegenüber zugesetzten, mit schweren Isotopen markierten Materialien wird empfohlen, um potenzielle Artefakte zu vermeiden, die bei der Probenhandhabung und -vorbereitung entstehen. Bedenken Sie jedoch, dass der Plasma- und Harnspiegel oxidierter Aminosäuren durch die Absorption oxidierter Aminosäuren aus Proteinen in der Nahrung oder durch eine erhöhte Gewebeproteolyse als Folge einer Pathologie verursacht werden kann. Beides wurde bisher noch nicht im Detail untersucht.

Cystein ist aufgrund seiner leichten Oxidation (insbesondere in seiner Thiolatform, RS−) und seiner Nukleophilie, die zu einer leichten Adduktbildung mit Elektrophilen führt, ein wichtiges Ziel für Modifikationen. Die Oxidation kann irreversibel sein – beispielsweise zu einer Sulfin- oder Sulfonsäure, die nützliche Biomarker für oxidative Proteinschäden sein können4,85. Die reversible Oxidation von Cys-Resten in Proteinen ist ein wichtiger Mechanismus der Redoxsignalisierung2,4. Zu den reversiblen Produkten gehören Disulfide, Sulfensäuren, S-Nitrosothiol und Persulfidspezies2,4,85,86,87. Diese Modifikationen können durch die GSH/Glutaredoxin- oder Thioredoxin-Systeme rückgängig gemacht werden87. Ein üblicher Ansatz zum Nachweis des Pools reversibel modifizierter Cys-Reste besteht darin, zunächst reduzierte Thiole mit einem reaktiven Reagens zu blockieren und dann die zuvor oxidierten Reste mit einem Tag zu reduzieren und zu derivatisieren, der durch LC-MS von tryptischen Verdaus identifiziert werden kann88. Diese Ansätze können auf die Verwendung einer modifikationsspezifischen Chemie erweitert werden, um nur ein bestimmtes Oxidationsprodukt zu markieren, beispielsweise ein S-Nitrosothiol, eine Sulfensäure oder ein Persulfid88. Bis vor kurzem bestanden die größten Einschränkungen dieser Ansätze in der geringen Abdeckung des gesamten Cys-Pools und der fehlenden Quantifizierung der Modifikation an einzelnen Resten87,88,89. Letzteres ist von besonderer Bedeutung für die Interpretation der biologischen Bedeutung reversibler Modifikationen. Erhebliche Verbesserungen bei der Quantifizierung wurden durch isobare Markierung erzielt, bei der reduzierte Cys-Reste zunächst mit einer Markierung markiert werden, reversibel modifizierte Reste reduziert und dann mit einer chemisch identischen, aber stark isotopenmodifizierten Markierung markiert werden, die die Quantifizierung des Anteils ermöglicht für jedes einzelne Cys oxidiert. Diese Methoden wurden auf Tags ausgeweitet, die Einheiten wie Biotin enthalten, die eine Anreicherung der markierten Peptide ermöglichen und so die Cys-Abdeckung erheblich verbessern. Die jüngste Version dieses Ansatzes, wie sie in der OxiMOUSe-Studie89 veranschaulicht wird, hat frühere Methoden abgelöst.

Methionin ist auch ein wichtiger Ort für posttranslationale Redoxmodifikationen. Die Oxidation zu Methioninsulfoxid kann enzymatisch durch Methioninsulfoxid-Reduktase-Enzyme rückgängig gemacht werden, was möglicherweise die Redoxsignalisierung durch den Einbau/Entfernung eines einzelnen Sauerstoffatoms erleichtert17. Für die Methionin-Biokonjugation wurden Reagenzien entwickelt, mit denen redoxempfindliche Methioninstellen in Proteomen identifiziert und charakterisiert werden können90.

Empfehlung 13: ELISA, FTC und Immunblotting sind nützliche Werkzeuge zum Nachweis von Proteincarbonylen als Biomarker für allgemeine oxidative Proteinschäden, obwohl berücksichtigt werden muss, dass nicht alle Proteinoxidationsprodukte Carbonyle enthalten. LC-MS-Ansätze unter Verwendung sorgfältig vorbereiteter Proben sind aufgrund der mit diesen Methoden verfügbaren Empfindlichkeit, Selektivität und Quantifizierung die besten verfügbaren Techniken zur Bewertung der Proteinoxidation. Auch der Einsatz orthogonaler Ansätze, etwa spezifischer und validierter Antikörper (siehe unten) gegen einzelne Oxidationsprodukte, wird gefördert.

Oxidative Modifikationen von DNA und RNA werden häufig als Biomarker für oxidative Schäden verwendet1,13,91. Eine Methode zur Beurteilung „allgemeiner“ oxidativer Schäden an DNA in Zellen ist der Comet-Assay, der DNA-Strangbrüche erkennt. Solche Brüche können durch verschiedene Mechanismen entstehen, nicht unbedingt durch oxidative Schäden, aber der Einsatz von Reparaturenzymen, die DNA an den Oxidationsstellen „klauen“, erhöht die Spezifität für oxidative DNA-Schäden. Die einfachste Messung ist die Länge des DNA-„Geisters“ nach der Elektrophorese von Zellen, die in ein Gel auf einem Objektträger eingebettet sind92.

Oxidative Schäden an der DNA konzentrieren sich normalerweise auf die Oxidation von Guanin zu 8-Oxo-7,8-dihydro-2′-desoxyguanosin (8OHdG oder 8-oxodG). Daten zu Modifikationen an anderen Basen sind begrenzt, obwohl diese wahrscheinlich biologisch wichtig sind1,13. Diese Messungen erfordern die Isolierung der DNA und ihren Verdau, um modifizierte Basen freizusetzen, und während der Probenhandhabung und -analyse kann es zu unerwünschter Oxidation kommen. Multi-Labor-Initiativen93 haben Protokolle erstellt, um dies zu vermeiden, und „normale“ 8OHdG-Werte ermittelt. Die in der DNA gemessene Menge an 8OHdG (oder einem anderen Produkt oxidativer DNA-Schädigung) ist das Gleichgewicht zwischen der Oxidations- und der Reparaturrate. Die beste Methode ist die Hochleistungs-LC-MS/MS (UPLC-MS/MS)94. Bei der Verwendung von ELISA-Methoden ist Vorsicht geboten, da es ihnen an Sensitivität und Spezifität mangelt und sie zwischen den Chargen zu unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Außerdem kommt es manchmal zu Kreuzreaktionen zwischen 8-Hydroxyguanosin (8OHG) und 8OHdG. Bei richtiger Anwendung kann die Immunhistochemie jedoch bei der Identifizierung von Zellen nützlich sein, die in vivo höhere Mengen an 8-OHdG aufweisen95.

Oxidierte Nukleoside sowohl von DNA als auch von RNA können in verschiedenen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden. Ursprünglich ging man davon aus, dass sie bei der DNA-Reparatur, insbesondere bei der Nukleotid-Exzisionsreparatur, entstehen. Sie entstehen jedoch auch durch Oxidation der DNA- und RNA-Nukleotid-Vorläuferpools, die durch Entfernung oxidierter Produkte „desinfiziert“ werden94. Die relativen Beiträge der DNA-Reparatur und der Sanierung des Nukleotidpools zu den in Körperflüssigkeiten nachgewiesenen Mengen oxidierter Nukleoside sind derzeit unklar. Der über 24 Stunden gesammelte Urin stellt die Anzahl der Guanine in DNA/RNA und/oder den jeweiligen Nukleotidvorläuferpools dar, die während dieses Zeitraums oxidiert wurden96. Die Urinprobe stellt eine Bildung im gesamten Körper dar und eignet sich am besten für Situationen, in denen davon ausgegangen wird, dass alle Gewebe betroffen sind. Sie kann jedoch bei der Erkennung von Veränderungen, die nur in bestimmten Organen auftreten, unzureichend sein. Die Messung in bestimmten Geweben stellt eine Momentaufnahme des Gleichgewichts zwischen Erzeugung und Reparatur dar und stellt möglicherweise keine Prozesse in anderen Organen dar.

Empfehlung 14: Bei der Messung oxidativer Modifikationen von Nukleinsäuren aus extrahierten Zellen oder Gewebeproben muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, Fehloxidationen in den präparativen und analytischen Schritten zu vermeiden. Methoden wie der Comet-Assay (unter Verwendung von DNA-Reparaturenzymen) an isolierten Zellen und UPLC-MS/MS zur 8OHdG- und 8OHG-Bestimmung in Körperflüssigkeiten oder aus Gewebe extrahierten Nukleinsäuren sind derzeit die besten verfügbaren Methoden. ELISA-basierte Methoden, insbesondere in Kit-Form, sind in der Regel nicht ausreichend validiert und ihr Einsatz wird nicht empfohlen.

Wie oben erläutert, werden Antikörper häufig zum Nachweis von Oxidationsprodukten (und auch Addukten) verwendet, die an Proteinen (z. B. Carbonylen und 3-Nitro- und 3-Chlortyrosin), DNA (z. B. 8-OxodG) und Lipiden (F2) gebildet werden -Isoprostane). Sie wurden beispielsweise in ELISA-, Immunhistochemie- und Immunpräzipitationsformaten verwendet, leiden jedoch häufig unter Hintergrundreaktivität, Kreuzreaktivität und mangelnder Spezifität. Um dies zu beheben, sollte das zur Erzeugung des Antikörpers verwendete Epitop dokumentiert werden (z. B. wie bei HNE)62,63,64 und Kontrollen zur Eliminierung des Hintergrunds sollten einbezogen werden. Zur Bestimmung der Selektivität wird die Blockierung durch authentische Proben des Epitops empfohlen. Eine relative Quantifizierung ist möglich, aber eine absolute Quantifizierung kann schwierig sein – beispielsweise aufgrund der schlechten Zugänglichkeit des Epitops (in Proteinen kann das Oxidationsprodukt beispielsweise verborgen sein). Darüber hinaus werden typischerweise Antikörper gegen unstrukturierte, chemisch modifizierte Peptide erzeugt und die erkannten Epitope wurden möglicherweise nicht immer bestimmt.

Empfehlung 15: Gut validierte Antikörper gegen bestimmte Produkte sind nützliche Nachweisinstrumente, wenn sie mit angemessener Sorgfalt und Kontrollen verwendet werden, einschließlich solcher für unspezifische Wechselwirkungen. Wettbewerbsdaten mit authentischen Epitopen sollten nach Möglichkeit einbezogen werden.

Die Messung von ROS in vivo ist eine Herausforderung. EPR-Methoden wurden entwickelt, finden jedoch noch keine breite Anwendung. Zu den biolumineszierenden Ansätzen für den ROS-Nachweis gehört peroxyaktiviertes Luciferin-1, das bei Oxidation in situ Luciferin bildet, das in Luciferase-transfizierten Systemen oxidiert wird, um Biolumineszenz zu erzeugen97. Wie bereits erwähnt, wurden in Tierversuchen genetisch kodierte Redox-Biosensoren eingesetzt. Mit der Entwicklung verbesserter Empfindlichkeit und Nachweismodalitäten wird die Positronenemissionstomographie nun zur Abbildung von ROS in vivo98 eingesetzt, steckt aber noch in den Kinderschuhen. In Mitochondrien von Zellen und Geweben können Veränderungen von H2O2 mithilfe des auf Mitochondrien gezielten Boronats MitoB beurteilt werden, das sich in diesen Organellen ansammelt und von H2O2 in MitoP umgewandelt wird. Das Verhältnis von MitoP zu MitoB kann dann mit MS99 bestimmt werden.

Da oxidative Schäden bei vielen Erkrankungen des Menschen eine zentrale Rolle spielen, besteht großes Interesse an der Entwicklung therapeutischer Interventionen zur Verringerung dieser Schäden1,2,3. Eine Folge davon ist, dass wir in klinischen Studien zeigen können sollten, wie sich diese Eingriffe auf oxidative Schäden auswirken. Beispielsweise wurden viele doppelblinde, randomisierte klinische Studien mit „Antioxidantien“ wie Beta-Carotin, Vitamin C und Vitamin E durchgeführt. Diese hatten im Allgemeinen keinen Einfluss auf die Krankheitsaktivität. Leider wurde in den meisten Fällen die Wirkung der Intervention auf oxidative Schäden nicht gemessen, was es ungewiss macht, ob die mutmaßliche Therapie tatsächlich bei der Verringerung oxidativer Schäden wirksam war. Wenn dies nicht der Fall war, ist eine fehlende Wirkung vorhersehbar1,55.

Um dieses Problem anzugehen, ist es wichtig, die Auswirkungen dieser Interventionen auf das Ausmaß der oxidativen Schädigung bei den Patienten in klinischen Studien zu bewerten. Derzeit beschränken sich die Methoden auf die Messung von Endpunkten oxidativer Schäden entweder in Biopsien (z. B. Haut oder Muskeln) oder in klinisch zugänglichen Körperflüssigkeiten wie Plasma, Speichel, Sputum oder Urin und manchmal auch in der Liquor cerebrospinalis. Zu diesen Biomarkern gehörten solche für die Oxidation von Nukleinsäuren wie 8OHG und 8OHdG100 sowie F2-Isoprostane als Biomarker der Lipidperoxidation69,101. Bisher wurden Biomarker der Proteinoxidation in klinischen Studien nur begrenzt genutzt. Es gibt jedoch Hinweise auf einen starken Zusammenhang zwischen Veränderungen im Protein-Thiol/Disulfid-Verhältnis und erhöhten Proteincarbonylen und anderen Modifikationen mit Pathologien75,76,77.

Generell sollten klinische Studien international validierte Biomarker umfassen: Der Biomarker sollte idealerweise einem Vergleich zwischen Laboren unterzogen worden sein. Viele Biomarker basieren auf der Messung der Konzentration in Körperflüssigkeiten wie Plasma, diese spiegeln jedoch nur das Gleichgewicht zwischen Bildungs- und Eliminationsraten wider und können daher nicht ohne weiteres als „oxidativer Stress“ interpretiert werden. Es wurden jedoch Modelle entwickelt, um die 24-Stunden-Produktion bestimmter Biomarker abzuschätzen100. Idealerweise sollte eine Reihe von Biomarkern verwendet werden54,55, da Endprodukte oxidativer Schäden an Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren nicht unbedingt miteinander korrelieren, was wir auch nicht erwarten würden, da es sich um unterschiedliche molekulare Ziele verschiedener ROS handelt.

Empfehlung 16: Wenn Sie mit Antioxidantien eingreifen, verwenden Sie zunächst Biomarker in vorläufigen Dosisfindungsstudien, um festzustellen, ob der Eingriff tatsächlich den oxidativen Schaden an den relevanten Biomolekülen verringert. Sie sollten klar definierte Biomarker umfassen, die mit einer validierten Methodik und/oder orthogonalen Ansätzen analysiert werden. Wir empfehlen in klinischen (oder anderen!) Studien nicht die Verwendung des d-ROMS-Assays (aus den in Ref. 1 erläuterten Gründen), TBARS, Bestimmungen der gesamten antioxidativen Aktivität1,102 oder kitbasierter Methoden, bei denen die Methodik hinter dem Kit steht ist unklar und/oder wurde nicht validiert.

Das Ziel dieser Konsenserklärung besteht darin, eine nützliche Ressource für Forscher aus verschiedenen Bereichen zu schaffen, die ROS messen und oxidative Ereignisse bewerten müssen, um ihre biologische Bedeutung zu untersuchen. Wir haben die Einschränkungen vieler derzeit verwendeter Verfahren besprochen und die derzeit besten verfügbaren Ansätze vorgeschlagen. Zwangsläufig werden in Zukunft neue Techniken entwickelt und angewendet, aber die Grundsätze unserer vorsichtigen Philosophie, die in unseren 16 Empfehlungen (zusammengefasst in Abb. 1) veranschaulicht werden, werden weiterhin gültig bleiben.

Hier haben wir die in diesem Manuskript entwickelten Empfehlungen für Best Practices zusammengefasst und gekürzt.

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Wir entschuldigen uns bei unseren Kollegen für die vielen wichtigen Dokumente, die wir aus Platzgründen nicht zitieren konnten, kombiniert mit der Breite der in einer Konsenserklärung erforderlichen Berichterstattung. Wir danken AJ Kowaltowski für hilfreiche Kommentare zum Manuskript. Die Arbeit im Labor des MPM wird durch ein Stipendium des Medical Research Council UK (Nr. MC_UU_00015/3) und durch einen Wellcome Trust Investigator Award (Nr. 220257/Z/20/Z) unterstützt. Die Arbeit in den Laboren von HB und VEK wird von den National Institutes of Health (NIH), USA, unterstützt (Fördernummern AI145406, CA165065, CA266342, HL114453, AI156924, NS076511, AI156923, NS061817 und NS117000). KJAD wurde durch Zuschuss Nr. unterstützt. ES003598 vom National Institute of Environmental Health Sciences des US-amerikanischen NIH und mit der Grant-Nr. AG052374 vom National Institute on Aging des US-amerikanischen NIH. RR wurde durch Zuschüsse der Universidad de la República, Uruguay (Nr. CSIC_2018 und EI_2020) unterstützt. Die Forschung im Labor von BH wird durch Zuschüsse des National Medical Research Council of Singapore, der National University of Singapore, der National Research Foundation, Singapur und der Tan Chin Tuan Foundation unterstützt. CJC wird vom NIH (Nr. GM 79465, GM 139245 und ES 28096) unterstützt und ist ein CIFAR-Stipendiat. Die Arbeit im ST-Labor wird von JST CREST (Fördernummer JPMJCR19H4), JSPS Kakenhi (Fördernummer JP16H06276[AdAMS], JP19H05462 und JP20H05502) und einem Forschungsstipendium des Princess Takamatsu Cancer Research Fund (Nr. 19-25126) unterstützt ). Die Arbeit im Labor von TPD wird durch Zuschüsse der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Nr. DFG, TRR184 und SPP2306) und des Europäischen Forschungsrats (Nr. 742039) unterstützt. Die Arbeit im Labor von HY wird durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32030053 und 32150710522) unterstützt. Die Arbeit im Labor von MJD wird von der Novo Nordisk Foundation unterstützt (Fördernummern NNF13OC0004294, NNF19OC0058493 und NNF20SA0064214). Die Arbeit im Labor von N.-GL wird vom Schwedischen Forschungsrat (2015-00418), der Schwedischen Krebsstiftung, der Knut-und-Alice-Wallenberg-Stiftung, dem Europäischen Forschungsrat (Advanced Grant 2016-741366) und der Novo Nordisk Foundation unterstützt. BH dankt Alvin Loo dafür, dass er das Problem zweifelhafter Kits zur Messung von ROS angesprochen hat.

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Graduiertenschule für Medizin der Universität Nagoya, Nagoya, Japan

Shinya Toyokuni

Abteilung für Pathologie und Biomedizin, University of Otago, Christchurch, Neuseeland

Christine C. Winterbourn

Shanghai Institute of Nutrition and Health, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China

Huiyong Yin

Neurobiogy-Programm des Instituts für Biochemie und Biowissenschaften, National University of Singapore, Singapur, Singapur

Barry Halliwell

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Der erste Anstoß für diese Konsenserklärung kam von BH und MPM, die sowohl die erste als auch die endgültige Fassung verfassten. HB, VB, CJC, KJAD, MJD, TPD, TF, HJF, YJ-H., DG, VEK, BK, N.-GL, GLM, TN, HEP, RR, HVR, PTS, PJT, ST, CCW und HY schrieb Teile des Manuskripts und redigierte und genehmigte das gesamte Manuskript.

Korrespondenz mit Michael P. Murphy oder Barry Halliwell.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Metabolism dankt Liron Bar-Peled, Kathy Griendling und Pietro Ghezzi für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handling: Christoph Schmitt, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Nachdrucke und Genehmigungen

Murphy, MP, Bayir, H., Belousov, V. et al. Richtlinien zur Messung reaktiver Sauerstoffspezies und oxidativer Schäden in Zellen und in vivo. Nat Metab 4, 651–662 (2022). https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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Eingegangen: 14. Januar 2022

Angenommen: 19. Mai 2022

Veröffentlicht: 27. Juni 2022

Ausgabedatum: Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

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