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Dec 07, 2023

Abschätzung eines Biofilms

npj Biofilme und Mikrobiome

npj Biofilms and Microbiomes Band 1, Artikelnummer: 15014 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Biofilme und insbesondere Harnstoff-hydrolysierende Biofilme sind für die medizinische Gemeinschaft (z. B. Harnwegsinfektionen), Wissenschaftler und Ingenieure (z. B. mikrobiell induzierte Karbonatfällung) von Interesse. Um diese Systeme angemessen zu modellieren, sind biofilmspezifische Reaktionsgeschwindigkeiten erforderlich. Eine einfache Methode zur Bestimmung biofilmspezifischer Reaktionsraten wird beschrieben und auf einen Harnstoff-hydrolysierenden Biofilm angewendet.

Biofilme wurden in kleinen Silikonröhrchen gezüchtet und die Harnstoffkonzentrationen im Zu- und Abfluss wurden bestimmt. Unmittelbar nach der Probenahme wurden die Röhrchen dünn geschnitten, um das Dickenprofil des Biofilms entlang der Röhrchenlänge abzuschätzen. Daten zur Harnstoffkonzentration und Biofilmdicke wurden verwendet, um ein inverses Modell zur Schätzung der Harnstoffhydrolyserate zu erstellen.

Es wurde festgestellt, dass die Harnstoffhydrolyse in Escherichia coli MJK2-Biofilmen durch eine Kinetik erster Ordnung zwischen Harnstoffkonzentrationen von 0,003 und 0,221 mol/l (0,186 und 13,3 g/l) gut angenähert wird. Der Ratenkoeffizient erster Ordnung (k1) wurde auf 23,2 ± 6,2 h−1 geschätzt. Es wurde außerdem festgestellt, dass im experimentellen System die Advektion statt der Diffusion dominierte und dass die Harnstoffhydrolyse innerhalb der Biofilme nicht durch den diffusiven Transport eingeschränkt wurde. Über den in dieser Arbeit diskutierten spezifischen Harnstoff-hydrolysierenden Biofilm hinaus hat die Methode das Potenzial für eine breite Anwendung in Fällen, in denen biofilmspezifische Raten bestimmt werden müssen.

Die Hydrolyse von Harnstoff durch Mikroorganismen hat sich weithin als wirksame Methode zur In-situ-Erzeugung von Alkalität und der anschließenden Ausfällung von Carbonatmineralien erwiesen. Bei einem neutralen pH-Wert kann die Hydrolyse von Harnstoff (CO(NH2)2) wie folgt beschrieben werden:

Dabei entstehen für jedes hydrolysierte Harnstoffmolekül zwei Ammoniumionen und ein Bicarbonation. Außerdem wird ein Proton verbraucht, was den pH-Wert erhöht. Wenn Kalzium oder andere zweiwertige Kationen vorhanden sind, kann es aufgrund eines Anstiegs der Karbonatkonzentration (CO32−) zur Ausfällung von Karbonatmineralien kommen.

Die Bildung von Karbonatmineralien durch mikrobielle Ureolyse ist in der Medizin von Bedeutung, da ureolytische Mikroorganismen bei der Bildung von Nieren- und Harnwegssteinen sowie Katheterverkrustungen eine Rolle spielen können.1,2 Die Mineralbildung durch Ureolyse wurde auch für technische Anwendungen in ausführlich untersucht Baumaterialien3 und im Untergrund zur Permeabilitätsreduzierung, Bodenstabilisierung und Schadstoffsanierung.4 Die mikrobielle Harnstoffhydrolyse ist auch in industriellen und landwirtschaftlichen Abwasseraufbereitungsanlagen von Interesse, wo ein erheblicher Anteil des gesamten Stickstoffs auf Harnstoff zurückzuführen ist.5 In allen genannten Systemen oben, insbesondere dort, wo das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen hoch ist, ist wahrscheinlich ein erheblicher Teil der ureolytischen Aktivität Biofilmen zuzuschreiben.

Ein wesentliches Hindernis bei der Vorhersage des Systemverhaltens in biofilmhaltigen Systemen ist das Fehlen einer quantitativen, systemspezifischen Charakterisierung des reaktiven Transports. Diese Studie befasst sich speziell mit der Ureolyse in einem Modellbiofilmsystem, um Aufschluss über die reaktive Transportumgebung zu geben, die wahrscheinlich in Systemen vorhanden ist, die eine ureolytische Aktivität aufweisen oder dazu angeregt wurden. Die Ureolyse in Planktonkulturen wurde gründlich untersucht und es gab eine Reihe von Studien zur Quantifizierung der volumengemittelten Ureolyseraten in porösen Medien, die Mikroorganismen6–9 und immobilisierte Enzyme enthalten.10,11 Die anwendbarsten Studien konzentrieren sich auf die Niederschlagsrate in diesen Systemen Die reaktiven Transporteigenschaften der Ureolyse in Biofilmen im Mikromaßstab bleiben weitgehend unbesprochen.

Anstatt einen volumengemittelten Ansatz zu wählen, wurden ureolytische Biofilme in Silikonröhrchen gezüchtet, die die laminare Strömungsumgebung nachahmen, die in einer Bodenpore oder einem Harntrakt anzutreffen wäre. Dem System wurden weder Kalzium noch andere Kationen zugeführt, die eine Mineralausfällung verursachen würden, so dass die Harnstoffhydrolyse im Detail untersucht werden konnte, ohne dass es zu den Komplikationen kam, die bei der Ausfällung auftreten. Niederschlag kann die Kinetik der Harnstoffhydrolyse beeinflussen, wurde in dieser Studie jedoch nicht untersucht. Die Silikonschläuche wurden destruktiv beprobt und dünn geschnitten, um ein genaues Biofilmdickenprofil über die Länge des Schlauchs zu erhalten. Biofilmdickenprofile wurden mit Messungen des ein- und ausströmenden Harnstoffs kombiniert, um eine Ureolyserate pro Biofilmvolumen zu erhalten (hier als biofilmspezifische Rate bezeichnet). Dieses Papier bietet eine Methode zur Messung effektiver Reaktionsraten in Biofilmen und einen besseren Einblick in die reaktive Transportumgebung der biofilmkatalysierten Harnstoffhydrolyse durch die Anwendung von Nichtdimensionalisierungstechniken.

Escherichia coli MJK2 (Lit. 12)-Biofilme wurden in 10 cm langen Silikonröhrchen der Größe 14 (Masterflex, Cole-Parmer, IL, USA) mit Harnstoffkonzentrationen im Zuflussbereich von 0,011 bis 0,221 mol/l (0,63 bis 13,3 g/l) gezüchtet ) bei Raumtemperatur (ca. 20 °C). E. coli MJK2 besitzt ein pJN105-Plasmid, das so modifiziert wurde, dass es das Urease-Operon von E. coli DH5α (pURE14.8) enthält, und trägt außerdem ein mutiertes chromosomales gfp (grün fluoreszierendes Protein-Gen).13,14 Experimente wurden durch die Injektion eingeleitet Inokulum in eine autoklavierte Reaktorbaugruppe geben und Zellen 1 Stunde lang anheften lassen. Einzelheiten zum Stamm und zur Vorbereitung des Inokulums finden Sie im ergänzenden Online-Material. Anschließend wurde der Fluss mit 1,0 ml/h (Reynolds-Zahl (Re) von 0,1 in einem sauberen Röhrchen) gestartet und 10 Tage lang mit einer KDS220-Mehrkanalspritzenpumpe (KD Scientific, Holliston, MA, USA) bei 1,0 ml/min gehalten. Der Fluss wurde nur für kurze Zeit unterbrochen, um sterile 60-ml-Kunststoffspritzen auszutauschen, die mit sterilem Medium gefüllt waren. Der Silikonschlauch wurde über einen PEEK-Schlauch mit kleinem Innendurchmesser (0,127 mm) mit der Spritze verbunden (siehe Abbildung 1). Der Schlauch mit kleinem Innendurchmesser soll die Verweilzeit minimieren und eine Umgebung mit hoher Scherung schaffen, die das Wachstum von Biofilmen im Zuflussschlauch nicht begünstigt. Ohne Biofilmwachstum beträgt die durchschnittliche hydraulische Verweilzeit 4,5 s im Zuflussrohr und 12,1 min im Silikonrohrreaktor.

Ein Schema für die Rohrreaktorbaugruppe. Steriles LB-Medium wird durch einen 10 cm langen Silikonschlauch mit 1,6 mm Innendurchmesser (ID) gepumpt, an dessen Wänden Biofilm wächst. Zur Verbindung der Spritze mit dem Rohrreaktor wurde ein Zuflussschlauch mit kleinem Innendurchmesser verwendet. Zur Entnahme von Zuflussproben wurde ein Dreiwegeventil verwendet, und das stromabwärtige Ende des Rohrreaktors wurde zur Entnahme von Abflussproben abgetrennt.

Nach 10 Tagen Biofilmwachstum wurden drei aufeinanderfolgende Abwasserproben und eine Zulaufprobe entnommen. Zur Demonstration des stationären Verhaltens wurden drei aufeinanderfolgende Abwasserproben entnommen. Röhrchen, bei denen die Harnstoffkonzentration im Abwasser mindestens einmal in Folge um 25 % vom Mittelwert der drei Proben abwich, wurden für die weitere Analyse nicht verwendet. Eine hohe Variation zwischen seriellen Replikaten weist auf vorübergehendes Verhalten hin, wie z. B. Ereignisse zur Ablösung von Biofilmen während der Probenahme, wodurch der Datensatz für die Modellierung ungeeignet ist. Die letzte aus jedem Röhrchen entnommene Abwasserprobe wurde als repräsentativ angesehen und in allen nachfolgenden Modellen verwendet, da sie bei der Vorbereitung der Dünnschnittproben am nächsten zum Ende des Experiments entnommen wurde.

Abflussproben wurden entnommen, indem das stromabwärtige Ende des Röhrchens abgetrennt wurde und das Medium eine Stunde lang mit der experimentellen Flussrate in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen fließen ließ. Die Zuflussprobe wurde zuletzt entnommen, indem der Fluss über das Dreiwegeventil zum Probenröhrchen geleitet wurde, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die leeren Mikrozentrifugenröhrchen wurden gewogen, 100 μl 3,8 % HCl wurden zugegeben, gewogen, Probe hinzugefügt und erneut gewogen. Der endgültige pH-Wert der Probe von etwa 1,5 stoppt wirksam die Ureolyse, da gezeigt wurde, dass das Urease-Enzym bei niedrigem pH-Wert an Aktivität verliert.15 Schließlich wurden die Proben durch einen Celluloseacetat-Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm (VWR, Randor, PA, USA) und zur späteren Messung der Harnstoffkonzentrationen mittels HPLC gekühlt. Unmittelbar nach der Entnahme der Flüssigkeitsprobe wurden die Silikonröhrchen zur Bestimmung der Biofilmdickenprofile durch Dünnschnitte zerstörerisch beprobt, wie im Abschnitt „Biofilmdickenmessungen“ beschrieben.

Unmittelbar nach der Flüssigkeitsprobenahme wurden die Röhrchen zerlegt, um ein Biofilmdickenprofil entlang der Länge jedes Röhrchens zu bestimmen. Jedes 10-cm-Rohr wurde in fünf 2 cm lange Abschnitte geschnitten. Der mittlere 1 cm jedes Abschnitts wurde herausgeschnitten und mit einem chirurgischen Skalpell der Länge nach halbiert. Die verbleibende Flüssigkeit wurde vorsichtig mit Seidenpapier abgesaugt, bevor Tissue-Tek OCT Compound (Sakura Finetek Inc., Torrance, CA, USA) auf den Querschnitt jedes Röhrchens verteilt und zum Einfrieren auf Trockeneis gelegt wurde. Sobald das OCT vollständig gefroren war, wurde der Querschnitt des Röhrchens abgezogen, wobei der im OCT eingebettete Biofilm zurückblieb. Eine mikroskopische Untersuchung ergab, dass kein nennenswerter Biofilm auf dem Röhrchen zurückblieb. Der gefrorene und eingebettete Biofilm wurde dann im OCT vollständig in einer Gewebe-Kryofixierungsform eingebettet. Die gefrorenen Proben wurden für die anschließende Dünnschnittbearbeitung bei –20 °C gelagert.

Die gefrorenen Biofilmproben wurden in 5 μm dicke Querschnitte geschnitten und in einem Leica CM1850-Kryostat montiert. Die Schnitte wurden auf geladene Objektträger (Fisherbrand Superfrost Plus Stain, Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) montiert und an der Luft getrocknet. Für jedes Rohrsegment wurden fünf Abschnitte entnommen. Das von den Bakterien produzierte grün fluoreszierende Protein wurde mittels Epifluoreszenzmikroskopie abgebildet. Dünnschnitte wurden auf einem Nikon E-800-Mikroskop abgebildet, das mit einer CoolSNAP MYO CCD-Kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA), einer PhotoFluor LM-75-Lichtquelle (89 North Inc., Burlington, VT, USA) und einem Nikon Plan Apo ausgestattet war 10X/0,45 DIC L ∞/0,17 WD 4,0 Objektiv und ein FITC-Filterwürfel (EX 480/30, DM 505 LP, EM 535/40). Die rohen 16-Bit-Bilder hatten eine Größe von 1.940 x 1.460 Pixel und eine Pixelgröße von 0,4499 μm. Alle Fluoreszenzbilder wurden mit einer Belichtungszeit von 2 s aufgenommen.

Rohbilder wurden in der Open-Source-Software FIJI16 mithilfe der automatischen Dreiecksmethode bewertet.17 Die Dreiecksmethode lieferte nachweislich die repräsentativsten Ergebnisse im Vergleich zu anderen häufig verwendeten Methoden wie Otsu (1979). Die Schwellenwertbilder wurden quantifiziert, um die durchschnittliche Biofilmdicke (Lf) zu bestimmen. Dies erfolgte durch Division der berechneten Bogenlänge des im Bild gezeigten Rohrabschnitts (0,923 mm, siehe Ergänzungstabelle SI) durch die Fläche des Biofilmquerschnitts, die aus dem Schwellenwertbild erhalten wurde.18 Bilder, die erhebliche Defekte enthielten wurden von der Analyse ausgeschlossen. Zu den Mängeln gehörten Staubpartikel, Blasen und geometrische Unregelmäßigkeiten, die zu Ungenauigkeiten bei den Dickenmessungen führen würden. Die durchschnittliche Dicke aller verwendbaren Replikate wird angezeigt (Dickenberechnungen und Rohdaten finden Sie in den Ergänzungstabellen SIII–SX). Es wurden keine Bilder aufgenommen, wenn die Proben keinen sichtbaren Biofilm enthielten und die Dicke als Null angegeben wurde. Abbildung 2 zeigt einen typischen Dünnschliff und die daran durchgeführte Analyse.

Ein repräsentatives Beispiel für ein Dünnschnittbild. (a) Ein Durchlichtbild zeigt eine qualitative Darstellung des Biofilms. (b) Das Fluoreszenzbild, das das Signal des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) zeigt, wird zur Quantifizierung verwendet. (c) Das GFP-Fluoreszenzbild wird mit einem Schwellenwert versehen, um zwischen Biofilm (weiß) und Hintergrund (schwarz) zu unterscheiden und so ein binäres Bild zu erzeugen. Die Fläche des Biofilmsignals wird quantifiziert und durch die berechnete sichtbare Bogenlänge (0,923 mm) dividiert, um eine repräsentative durchschnittliche Biofilmdicke zu berechnen.

Harnstoff wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit In-Autosampler-Derivatisierung analysiert.12,19

Rohrreaktoren wurden mit COMSOL Multiphysics Version 4.3a (COMSOL Inc., Burlington, MA, USA) modelliert, um kinetische Parameter an den gemessenen Harnstoffverbrauch über die Länge der Rohrreaktoren anzupassen. Die Rohrreaktoren wurden als zweidimensionale rotierte achsensymmetrische Geometrie modelliert. Navier-Stokes-Gleichungen wurden gelöst, um ein Strömungsfeld zu erhalten, und es wurde angenommen, dass es im Biofilmbereich keinen Flüssigkeitsfluss gibt. Die Dünnschnittdaten wurden verwendet, um das Biofilmprofil für jeden Rohrreaktor zu rekonstruieren. Es wurde angenommen, dass die Biofilmdicke für diskrete x-Werte konstant war (siehe Abbildung 3 für Modellkoordinaten) und die Dicke zwischen den gemessenen Punkten linear interpoliert wurde. Die Dicke des Biofilms konnte nicht unmittelbar am Zu- oder Abfluss der Reaktoren (x=0 und 10 cm) gemessen werden, da aufgrund der Entfernung der Siliziumröhren aus dem Versuchssystem mögliche Artefakte auftreten könnten. Daher wurde angenommen, dass Lf bei x=0 liegt cm entsprach Lf bei x=1 cm und Lf bei x=10 cm entsprach Lf bei x=9 cm. Der Harnstofftransport wurde mit Advektion durch das Navier-Stokes-Strömungsfeld und Fickian-Diffusion berechnet. Es wurde keine Verringerung des Diffusionstransports im Biofilmbereich berücksichtigt, sodass davon ausgegangen wurde, dass die Diffusionseigenschaften während der gesamten Simulation konstant waren. Vorläufige Analysen zeigten, dass die Implementierung eines erhöhten Massentransportwiderstands von gelösten Stoffen im Biofilm wie in Lit. 20 wirkten sich minimal auf die Ratenanpassung aus (<1 % Unterschied in den dicksten Biofilmen, Daten nicht gezeigt). Randbedingungen und Modellannahmen sind in Abbildung 3 dargestellt.

COMSOL-Modellübersicht mit Randbedingungen.

Es wurde angenommen, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der Harnstoffhydrolyse, R, innerhalb des gesamten Biofilms in jedem Röhrchen konstant ist (unabhängig von der Konzentration) und auf den Biofilmbereich beschränkt ist (keine Reaktion in der flüssigen Phase). Die Begründung für die Annahme einer konstanten Reaktionsgeschwindigkeit folgt im Abschnitt „Charakterisierung des reaktiven Transports“. Die Harnstoffkonzentrationen im Zu- und Abfluss sind bekannt, daher wurde die Harnstoffhydrolyserate so angepasst, dass die experimentell ermittelten Konzentrationen zum Modell passen. Die Harnstoffkonzentration an der Auslassgrenze ist räumlich (d. h. über den Querschnitt des Auslasses) nicht konstant; Anstatt also den Unterschied zwischen modellierten und experimentellen Konzentrationen direkt zu minimieren, wurde der Unterschied zwischen dem modellierten und experimentellen Harnstofffluss, gemittelt über den Rohrquerschnitt, minimiert. Die letzte der drei Harnstoffkonzentrationen im Abwasser wurde als repräsentative Durchschnittskonzentration über den Querschnitt des Rohrs angesehen, da sie dem Zeitpunkt der zerstörenden Probenahme am nächsten lag. Der bekannte Harnstofffluss im Abwasser, JEF, kann berechnet werden, indem die Konzentration des Abwassers, CEF, mit der volumetrischen Durchflussrate Q multipliziert wird

CEF ist ein durchschnittlicher und gut gemischter Wert. Der modellierte gesamte Harnstofffluss im Abwasser, J'EF, wurde durch Integration über die Fläche der flüssigen Phase am Abwasser berechnet, so dass

Dabei ist u die x-Komponente der Flüssigkeitsgeschwindigkeit, C die lokale Harnstoffkonzentration und ID der Rohrinnendurchmesser (1,6 mm). Das Modell wurde iterativ ausgeführt, wobei die Ureolyserate des Biofilms so variiert wurde, dass die Summe des quadratischen Fehlers zwischen JEF und J′EF minimiert wird. Das COMSOL-Optimierungsmodul wurde verwendet, um eine Harnstoffhydrolyserate R zu finden, die den quadratischen Fehler (JEF−J'EF)2 minimiert, unter Verwendung der Nelder-Mead-Methode21,22 mit einer nichtdimensionalen Anpassungstoleranz von 10−6.

Die angepassten Geschwindigkeitswerte für jedes Röhrchen wurden in einem Datensatz zusammengestellt, der die Reaktionsgeschwindigkeiten bei verschiedenen Harnstoffkonzentrationen darstellt. Für jedes Röhrchen wurde eine durchschnittliche Harnstoffkonzentration innerhalb des Biofilmvolumens, CUrea,BF, berechnet und als repräsentative Harnstoffkonzentration entsprechend der angepassten Rate angenommen. Eine Michaelis-Menten (M–M)-Rate (Rm–m)-Beziehung wurde an die zusammengestellten Daten angepasst, indem das Tool zur Kurvenanpassung der kleinsten Quadrate (cftool) in MATLAB R2012a (The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA) verwendet wurde:

Rmax ist die maximale Ureolyserate und km ist ein halber Sättigungskoeffizient. Es wurde die Theorie aufgestellt, dass die M-M-Beziehung am besten zu den Daten passen würde, andere Ratenbeziehungen eigneten sich jedoch zum Vergleich. Für eine Reaktion der Ordnung n in Bezug auf die Harnstoffkonzentration kann ein verallgemeinertes Geschwindigkeitsgesetz geschrieben werden als

Beziehungen erster Ordnung (n=1, linear) und nullter Ordnung (n=0, konstante Rate) wurden bereits früher zur Beschreibung der mikrobiellen Ureolyse verwendet7,12,23,24 und wurden daher auch in die Regressionsanalyse einbezogen.

In allen Rohrreaktoren wurde nach 10 Tagen Betrieb eine messbare Harnstoffhydrolyse beobachtet. Die Harnstoffkonzentrationen im Zulauf schwankten zwischen 0,011 und 0,221 mol/l. Die Abwasserkonzentrationen schwankten zwischen 0,003 und 0,208 mol/l, einschließlich aller seriellen Replikate. Die Röhrchen 5, 10 und 11 wurden aus der Analyse ausgeschlossen, da die Steady-State-Bedingung nicht erfüllt war (>25 % Abweichung vom Mittelwert). Für alle Harnstoffmessungen wird der Leser auf die Ergänzungstabelle SII verwiesen.

Biofilmprofile wurden erfolgreich aus 11 Rohrreaktorläufen erhalten. Die Dicke des Biofilms lag zwischen 0,6 und 222,0 μm, mit einem Durchschnitt aller Beobachtungen von 18,7 μm. Unter der Annahme einer Nullströmung durch den Biofilm ist in allen Rohrreaktoren eine laminare Strömung zu erwarten (für den Reaktor mit dem dicksten beobachteten Biofilm wurde ein maximaler Re=0,18 berechnet).

Für jeden Profilpunkt wurden fünf wiederholte Biofilmdickenmessungen durchgeführt. 5,5 % der Messungen wurden aufgrund offensichtlicher Unregelmäßigkeiten wie Blasen im Schneidmedium, Staubpartikeln und deformierten Abschnitten aus der Analyse ausgeschlossen. Alle vorgestellten Biofilmdickenmessungen wurden mindestens doppelt durchgeführt, mit einem Durchschnitt von 4,7 Messungen pro Dickewert. Rohe Biofilmmessungen finden Sie im ergänzenden Online-Material und die im Modell verwendeten Durchschnittsprofile sind in Abbildung 4 zu finden.

Harnstoffkonzentration, wie vom reaktiven Transportmodell für jeden in der Analyse verwendeten Rohrreaktor vorhergesagt. Die Konzentrationskarte für alle Röhrchen wird mit der gleichen Farbskala dargestellt, was deutlich macht, dass jedes Röhrchen einen unterschiedlichen, aber innerhalb jedes Röhrchens sehr engen Bereich der Harnstoffkonzentration aufwies. Biofilmprofile für jedes Röhrchen, die aus Mikroskopiedaten erhalten wurden, werden in jedem Panel als weiße Linien angezeigt. Beachten Sie die sehr geringen Konzentrationsgradienten radial nach außen von der Mitte der Röhren.

Es gibt einige eindeutige Fehlerquellen im Zusammenhang mit dem Rohrreaktor-Experiment, die behoben werden müssen. Es wird erwartet, dass die größte Fehlerquelle bei der Definition des Biofilmdickenprofils liegt. Wenn die Biofilmdicke im gesamten Rohr nicht gut charakterisiert ist, sind die berechneten Raten nicht genau, da die Ratenanpassung implizit von der Menge des vorhandenen Biofilms abhängt. Es gibt fünf potenzielle Fehlerquellen für die Schätzung des Biofilmdickenprofils: (i) Biofilm am Zu- und Abfluss der Rohre kann nicht genau quantifiziert werden, (ii) die Biofilmdicke zwischen Messpunkten kann durch lineare Interpolation möglicherweise nicht gut angenähert werden, (iii) Die Dicke des Biofilms ist möglicherweise nicht über den gesamten Querschnitt des Röhrchens konstant und (iv) es besteht die Möglichkeit, dass während der Probenahme für die wässrige Analyse erhebliche Ablösungsereignisse auftreten.

Bei den ersten drei potenziellen Fehlerquellen besteht das Problem darin, dass die gesamte Röhre und der darin enthaltene Biofilm nicht vernünftig dreidimensional abgebildet werden können. Diese Fehler stehen in direktem Zusammenhang mit der mangelnden Möglichkeit, Proben mit hoher räumlicher Auflösung durchzuführen, und können als zufällige Fehler betrachtet werden. Es ist zu erwarten, dass bei zufälligen Fehlern in diesem System die Wahrscheinlichkeit einer Überschätzung ebenso groß ist wie die Wahrscheinlichkeit einer Unterschätzung. Mit anderen Worten: Es ist genauso wahrscheinlich, dass bei der Probenahme ein dicker Biofilmbereich übersehen wird wie ein dünner Bereich. Obwohl fortgeschrittenere Techniken erforderlich wären, kann das Problem der geringen räumlichen Auflösung gelöst werden. Dreidimensionale Bildgebungstechniken wie die Röntgenmikrotomographie25–27 und die Kernspinresonanztomographie28,29 haben das Potenzial, einfache Biofilmsysteme abzubilden und die Biofilmgeometrie besser mit effektiven Schätzungen der Reaktionsgeschwindigkeit zu verknüpfen.

Fehler im Zusammenhang mit Ablösungsereignissen während des Probenahmevorgangs können hier nicht quantifiziert werden, aber das Vorzeichen des Fehlers und seine Auswirkungen sind bekannt. Wenn es während der wässrigen Probenahme oder zwischen der Probenahme und dem Dünnschnitt zu einer großen Ablösung kommen würde, wäre das Biofilmprofil während der wässrigen Probenahme unbekannt, aber es müsste dicker sein, als es in den Dünnschnitten gezeigt würde. Dies würde aufgrund der Unterschätzung des Biofilmvolumens immer zu einer Überschätzung der effektiven Reaktionsrate in diesem bestimmten Röhrchen führen. Ähnlich wie bei der anderen Klasse zufälliger Fehler könnte dieses Problem durch den Einsatz fortschrittlicherer dreidimensionaler Bildgebungstechniken minimiert werden. Diese fortgeschritteneren Techniken müssten dennoch sorgfältig eingesetzt werden, um den Biofilm nicht zu stören.

Es gibt eine weitere potenzielle Fehlerquelle, die nicht mit der Schätzung der Biofilmdicke zusammenhängt. Dies hängt mit der Annahme zusammen, dass der Biofilm homogen ist. Es könnte Unterschiede in der Zelldichte, der Enzymproduktion (in diesem Fall Urease) oder der allgemeinen Stoffwechselaktivität geben, die zu Ungenauigkeiten bei der Schätzung der Geschwindigkeitskonstanten führen könnten. Diese Möglichkeit wurde in dieser Studie nicht direkt untersucht, ihr Einfluss kann jedoch nicht ausgeschlossen werden und sollte im Mittelpunkt künftiger Arbeiten stehen. Systeme mit Elektronendonor- oder -akzeptorbeschränkung wären für solche zukünftigen Studien besonders interessant.

Die Damköhler-Zahl (Da) ist definiert als die Zeitskala des konvektiven Transports geteilt durch die Zeitskala der Reaktion innerhalb eines Kontrollvolumens.30 Für eine Reaktion erster Ordnung kann die Damköhler-Zahl definiert werden als

wobei τ die durchschnittliche Flüssigkeitsretentionszeit ist. Dieser Standardausdruck für Da erfordert eine Modifikation für ein System mit Raten, die so definiert sind, dass sie nur in der Biofilmphase auftreten. Gleichung (6) geht davon aus, dass die Reaktion innerhalb des gesamten Volumens stattfindet, für das τ berechnet wird (dem Flüssigkeitsvolumen). In diesem Fall findet die Reaktion nicht im Flüssigkeitsvolumen statt, daher müssen die Transportgeschwindigkeit und die Reaktionsraten für die Volumina, in denen sie stattfinden, normalisiert werden.

In ähnlicher Weise kann die Péclet-Zahl (Pe) als das Verhältnis der Advektionsrate eines gelösten Stoffes zur Diffusionsrate desselben gelösten Stoffes definiert werden.31 Die Péclet-Zahl kann ausgedrückt werden als:

Dabei ist D der Diffusionskoeffizient, der für Harnstoff in reinem Wasser bei 25 °C 1,38×10−9 m2/s beträgt (Lit. 31), v die durchschnittliche Flüssigkeitsgeschwindigkeit und L eine repräsentative Längenskala. Die Werte von v und L können basierend auf dem, was im System charakterisiert wird, ausgewählt werden. In diesem Fall ist sowohl das axiale als auch das radiale Verhalten von Interesse, weshalb zwei Péclet-Zahlen definiert werden. Die erste, Pex, charakterisiert das axiale Verhalten, wobei die Geschwindigkeit als durchschnittliche Größe der x-Komponente der Geschwindigkeit, vx, angenommen wird. Der zweite Wert, Per, charakterisiert das radiale Verhalten, wobei die Geschwindigkeit als durchschnittliche Größe der r-Komponente der Geschwindigkeit, vr, angenommen wird. Die Längenskalen unterscheiden sich für radiales und axiales Verhalten. Die Rohrlänge ltube ist die Längenskala für axiale Strömung und der Rohrdurchmesser dtube ist die Längenskala für radiale Strömung

Und

Der letzte betrachtete dimensionslose Parameter ist der Thiele-Modul (ϕ), der das Verhältnis der Zeitskala der Reaktion zur Zeitskala der Diffusion darstellt. Der Thiele-Modul ist für Reaktionen erster Ordnung einfach zu berechnen.31

Die Längenskala (L) ist hier eine Biofilmdicke (Lf), da der Thiele-Modul in diesem Fall als Maß zur Quantifizierung einer möglichen Diffusionsbegrenzung der Biofilme in diesem System berechnet wird. Die Dicke des Biofilms ist in diesen Systemen nicht konstant, daher werden durchschnittliche Hoch- und Tiefwerte für jedes Röhrchen verwendet, um das Gesamtverhalten zu bestimmen. Tabelle 1 zeigt die berechneten dimensionslosen Parameter (Durchschnitt, Minimum und Maximum) für jeden Rohrreaktor in der Studie. Die bei der Berechnung der dimensionslosen Parameter verwendeten Werte wurden dem im Abschnitt „Kinetische Parameteranpassung“ beschriebenen Finite-Elemente-Modell entnommen.

Im Allgemeinen zeigt die dimensionslose Parameteranalyse, dass Advektion das System dominiert (anstelle von Diffusionstransport und Harnstoffhydrolyse) und dass die Biofilme nicht durch Diffusion begrenzt sind. Die Damköhler-Zahl zeigt, dass für dieses spezielle System die Zeitskala des advektiven Transports größer ist als die Zeitskala der Reaktion. Die axialen Péclet-Zahlen sind alle viel größer als eins (Pex ≫ 1), was darauf hindeutet, dass das System stark von Advektion dominiert wird. Nur ein kleiner Teil des axialen Harnstofftransports kann zur Diffusion beitragen. Die radiale Péclet-Zahl zeigt an, dass der advektive und der diffusive Harnstofftransport ausgeglichener sind, wobei der diffusive und advektive Transport in radialer Richtung gleichmäßiger beitragen.

Es gibt zwei Hauptmerkmale, die Per unter der Annahme eines konstanten Diffusionskoeffizienten steuern. Erstens beeinflusst die Massendurchflussrate Per; Eine höhere Gesamtdurchflussrate des Systems führt zu höheren Gesamtgeschwindigkeiten, einschließlich Radialgeschwindigkeiten. Zweitens wirkt sich die Heterogenität des Biofilmprofils direkt auf die Radialgeschwindigkeiten aus; Wenn das Biofilmprofil konstanter wird (d. h. am nächsten an Lf, das bei allen x-Werten gleich ist), nimmt die durchschnittliche Radialgeschwindigkeit ab, wodurch sich Per verringert. Es ist auch zu erwarten, dass die Heterogenität der Flussrate und der Biofilmdicke miteinander verknüpft sein könnte. Obwohl diese physiologische Beziehung hier nicht untersucht wurde, wurde gezeigt, dass sich Biofilme an ihre Scher- und Transportumgebungen für gelöste Stoffe anpassen.32,33 Es wurde gezeigt, dass E. coli-Biofilme ihre Architektur an spezifische hydrodynamische und Nährstoffbedingungen anpassen. Insbesondere wenn Nährstoffe im Übermaß bereitgestellt werden (wie in dieser Studie aufgrund hoher Da- und niedriger ϕ-Werte erwartet wird), haben sich E. coli-Biofilme nachweislich angepasst, um Scherstress zu widerstehen.34

Der Thiele-Modul war der variabelste dimensionslose Parameter im System, es wurde jedoch festgestellt, dass alle Werte kleiner als eins waren, was darauf hindeutet, dass die Zeitskala für die Diffusion im Allgemeinen kürzer ist als die Zeitskala für die Reaktion. Dies bedeutet, dass die Harnstoffhydrolyse innerhalb von Biofilmen in dieser Studie nicht stark diffusionsbegrenzt ist. Mit anderen Worten: Es wird erwartet, dass die Konzentrationen der Hauptflüssigkeit ungefähr den Konzentrationen im Biofilm entsprechen (d. h. keine steilen Gradienten der Harnstoffkonzentration). Dieser Befund ist eine wichtige Bestätigung für den Ansatz, der zur Bestimmung der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten gewählt wurde, wobei davon ausgegangen wurde, dass die Reaktionsgeschwindigkeit und die entsprechende Biofilm-Harnstoffkonzentration (CUrea,BF) in jedem Röhrchen konstant sind. Visuelle Beweise für das Verhalten eines kleinen Thiele-Moduls sind auch in Abbildung 4 zu finden, wo sich die Harnstoffkonzentration innerhalb der Biofilme im Vergleich zur Hauptflüssigkeit scheinbar nicht wesentlich ändert.

Rohrreaktoren, die die stationären Kriterien erfüllten, wurden mithilfe einzelner Finite-Elemente-Modelle modelliert, und die Harnstoffhydrolyserate R wurde variiert, bis die Unterschiede zwischen den modellierten und experimentellen Harnstoffflüssen minimiert waren. Als repräsentative Konzentration, die der berechneten Reaktionsgeschwindigkeit entspricht, wurde angenommen, dass es sich um die durchschnittliche Harnstoffkonzentration innerhalb des Biofilmvolumens jedes Röhrchens handelt.

Die resultierenden Daten aus den Finite-Elemente-Modellen ermöglichten eine Regressionsanalyse unter Berücksichtigung von Michaelis-Menten (M–M) sowie Ratenmodellen erster und nullter Ordnung. Eine Darstellung der Harnstoffhydrolyse-Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der repräsentativen Konzentration zusammen mit den Geschwindigkeitsmodellanpassungen finden Sie in Abbildung 5. M-M-Modelle und Modelle erster Ordnung passen am besten zu den Daten (quadratischer Fehler von 1,01 und 0,97 mol/(l·h). bzw.), während die nullte Ordnung im Vergleich zu den anderen eine schlechte Anpassung aufwies (quadratischer Mittelwertfehler = 1,56 mol/(l·h)). M–M- und Modellanpassungen erster Ordnung unterscheiden sich statistisch nicht mit einer Konfidenz von 95 % über den in dieser Studie berücksichtigten Konzentrationsbereich. Die Geschwindigkeitskonstanten für das M-M-Modell wurden auf km=0,55 mol/l und rmax=15,9 mol/(l·h) und für das Modell erster Ordnung auf k1=23,2±6,2 h−1 (± ist das 95 %-Konfidenzintervall) geschätzt ).

Durchschnittliche Harnstoffkonzentration im Biofilmvolumen im Vergleich zur geschätzten Harnstoffhydrolyserate. Die modellierten Punkte entsprechen der von den Finite-Elemente-Modellen berechneten Rate gegenüber der durchschnittlichen Harnstoffkonzentration im Biofilmvolumen, CUrea,BF. Fehlerbalken stellen den Bereich der Harnstoffkonzentration innerhalb des Biofilmvolumens dar, wie durch die Finite-Elemente-Modelle geschätzt. Punkte sind mit den Rohrreaktornummern gekennzeichnet, aus denen sie gewonnen wurden (siehe zum Beispiel Abbildung 4).

Der Nachweis des Verhaltens erster Ordnung ist wichtig für die Modellierung komplexerer Systeme und ein wesentliches Ergebnis dieser Arbeit. Andere verwendeten Kinetiken erster Ordnung für Ureolysesysteme mit ureolysegesteuerter Mineralisierung;7,23 Die Anwendbarkeit dieses Modells war jedoch bisher für kein Biofilmsystem nachgewiesen. Bei Reaktionen, die der M-M-Kinetik folgen, wie für die Harnstoffhydrolyse gezeigt wurde,11,15,35 wird typischerweise angenommen, dass Kinetiken erster Ordnung nur auf Systeme angewendet werden sollten, bei denen das Reaktionssubstrat eine niedrige Konzentration aufweist (C ≪ km). Die hier gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, dass veröffentlichte kinetische Werte aus reinen Enzym- oder planktonischen biologischen Experimenten möglicherweise nicht für die Verwendung in Systemen geeignet sind, in denen anhaftende Zellen und Biofilme der primäre Katalysator sind. Als Grund für unterschiedliches kinetisches Verhalten in Biofilmen wird routinemäßig eine Diffusionsbeschränkung angeführt. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen jedoch nahe, dass kinetische Unterschiede auch ohne Hinweise auf signifikante Einschränkungen des diffusiven Massentransports auftreten können.

Die Massentransportbeschränkung von Harnstoff wurde in dieser Analyse unabhängig von anderen gelösten Stoffen berücksichtigt. Als Beispiel könnte auch die Sauerstofflimitierung untersucht werden, da Biofilme in der Natur oft zumindest teilweise sauerstofflimitiert sind. In dieser Studie wird nicht erwartet, dass Sauerstoff aufgrund der hohen Gasdurchlässigkeit der verwendeten Silikonschläuche eine Einschränkung darstellt. In natürlichen Systemen kann es jedoch zu Sauerstoffmangel kommen, was sich auf die Kinetik der Harnstoffhydrolyse auswirken könnte. Daher müssen bei der Anwendung des in dieser Studie beschriebenen Ansatzes möglicherweise Einschränkungen des Massentransports anderer gelöster Stoffe in anderen Systemen berücksichtigt werden.

Die vorgestellte Studie hat direkte und indirekte Anwendungen. Die direkteste Anwendung dieser Arbeit ist die Fortsetzung von Laborstudien mit E. coli MJK2. Die in dieser Studie erhaltenen biofilmspezifischen kinetischen Parameter können in Verbindung mit Werkzeugen wie konfokaler Mikroskopie, Durchflusszellen und Finite-Elemente-Modellierung in komplexeren Systemen verwendet werden, um lokale chemische Gradienten innerhalb ureolytischer Biofilme weiter zu untersuchen. Zu den Systemen, die besonders gut geeignet wären, gehören Harnleiterkatheter1 und die durch Harnstoffhydrolyse gesteuerte mikrobielle Karbonatfällung.3,4

Über speziell Harnstoffhydrolysesysteme hinaus stellt dieser Artikel eine robuste Methode zur systematischen Charakterisierung effektiver Reaktionsraten in Biofilmen in Strömungssystemen vor. Der kleine Maßstab der Röhrenreaktormethode bietet Vorteile gegenüber gängigeren Biofilmreaktoren im Labormaßstab wie dem CDC-Reaktor,36 Ringreaktoren37 oder Tropfströmungsreaktoren.38 Die Hauptvorteile beziehen sich auf die Kosten und die Abfallreduzierung. Der einfache Rohrreaktor erfordert außer einer Spritzenpumpe oder einer ähnlichen Pumpe, die für einen konstanten und langsamen Fluss sorgt, keine spezielle Ausrüstung. Die Scherumgebung kann auch leicht an die spezifischen Anforderungen der Studie angepasst werden, indem die Durchflussrate oder die Rohrgröße variiert wird. Die Rohrreaktormethode eignet sich auch gut für Untersuchungen, bei denen gefährliche Materialien verwendet werden. Studien, die sich auf die Quantifizierung des Abbaus gefährlicher Substanzen durch Biofilme konzentrieren, können in Untersuchungen mit kleinen Röhrenreaktoren Anwendung finden, da Experimente so konzipiert werden könnten, dass nur minimale Mengen gefährlicher Abfälle entstehen (z. B. chlorierte Aromaten, Kohlenwasserstoffe, Nitroaromaten und Pharmazeutika). Studien, bei denen kostenintensive Substrate verwendet werden (z. B. stabile Isotopenverbindungen), könnten auch im Rohrreaktorsystem Anwendung finden. Im Vergleich zu Ansätzen mit größerem Volumen weist die Rohrreaktormethode auch Nachteile auf. Einige Studien erfordern möglicherweise größere Probenvolumina für mehrere Analysen, was die Verwendung eines solchen Systems mit niedriger Durchflussrate unpraktisch macht.

Es wurde festgestellt, dass das spezielle System, das in dieser Arbeit analysiert wurde, nicht diffusionsbegrenzt war und der Konzentrationsbereich für jedes Röhrchen klein war. In diesem Fall hätte eine viel einfachere Berechnung durchgeführt werden können, um die effektive volumetrische Reaktionsgeschwindigkeit im Biofilmreaktor zu bestimmen. Wenn die Konzentration im gesamten Biofilmvolumen als konstant betrachtet werden kann, könnte eine durchschnittliche Reaktionsgeschwindigkeit im Biofilm in jedem Röhrchen bestimmt werden, indem einfach das Biofilmvolumen berechnet und durch die Konzentrationsdifferenz über das Röhrchen dividiert wird. Die Annahme einer konstanten Konzentration kann nicht für alle Systeme getroffen werden, daher wurde hier der strengere Ansatz der inversen Modellierung vorgestellt. Wenn größere Moleküle mit niedrigeren Diffusionskoeffizienten Gegenstand einer kinetischen Analyse sind oder dickere Biofilme vorhanden sind, wäre im Allgemeinen immer noch die strengere Methode erforderlich.

Die Bestimmung biofilmspezifischer Reaktionsraten ist wichtig für die genaue Modellierung von Biofilmsystemen im Mikromaßstab. In dieser Arbeit wurden biofilmspezifische Geschwindigkeitskoeffizienten der Harnstoffhydrolyse (sowohl Michaelis-Menten- als auch Geschwindigkeitsmodelle erster Ordnung) in einem Rohrreaktorsystem bestimmt. Es wurde festgestellt, dass für die in dieser Studie vorliegenden chemischen und hydrodynamischen Bedingungen ein (lineares) Geschwindigkeitsmodell erster Ordnung die Daten zur Reaktionsgeschwindigkeit gegenüber der Konzentration anpasst, ebenso wie das Michaelis-Menten-Modell, mit dem rechnerisch schwieriger zu arbeiten ist. Diese Arbeit zusammen mit der vorherigen Charakterisierung von E. coli MJK2 in planktonischen Kulturen macht den Organismus zu einem wertvollen Werkzeug für die Untersuchung verschiedener Aspekte der Ureolyse in Biofilmen. Zu den Anwendungen gehören medizinische, umweltwissenschaftliche und technische Forschungsthemen. Über die spezifischen Erkenntnisse im Zusammenhang mit der Ureolyse hinaus lässt sich die in dieser Arbeit vorgestellte Methode auch auf andere Biofilme anwenden, bei denen eine biofilmspezifische Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden muss.

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Die Autoren wurden von der National Science Foundation durch den NSF-Preis Nr. DMS-0934696 und durch die Zuschussnummern DE-FG-02-09ER64758, DE-FE0004478, DE-FE0009599 und DE-FG02-13ER86571 des US-Energieministeriums finanziert. JMC wurde außerdem durch ein NSF-IGERT-Stipendium für Geobiologische Systeme an der Montana State University (DGE-0654336) unterstützt.

Zentrum für Biofilm-Engineering, Montana State University, Bozeman, MT, USA

James M. Connolly, Benjamin Jackson, Adam P. Rothman und Robin Gerlach

Abteilung für Chemie- und Bioingenieurwesen, Montana State University, Bozeman, MT, USA

James M. Connolly, Adam P. Rothman und Robin Gerlach

Fakultät für Mathematische Wissenschaften, Montana State University, Bozeman, MT, USA

Benjamin Jackson

Fakultät für Mathematik, Temple University, Philadelphia, PA, USA

Isaac Klapper

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JMC hat das Manuskript geschrieben. JMC und RG entwickelten das experimentelle Design. JMC und APR führten die Experimente durch. JMC entwickelte das inverse Modell, das von BJ, IK und RG kritisch bewertet wurde. Das Manuskript wurde von IK und RG bearbeitet und alle Autoren überprüften und genehmigten das Manuskript.

Korrespondenz mit Robin Gerlach.

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Ergänzende Informationen liegen dem Artikel auf der Website von npj Biofilms and Microbiomes (http://www.nature.com/npjbiofilms) bei.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Connolly, J., Jackson, B., Rothman, A. et al. Abschätzung einer biofilmspezifischen Reaktionsrate: Kinetik der bakteriellen Harnstoffhydrolyse in einem Biofilm. npj Biofilms Microbiomes 1, 15014 (2015). https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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Eingegangen: 26. November 2014

Überarbeitet: 26. April 2015

Angenommen: 4. Juli 2015

Veröffentlicht: 16. September 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/npjbiofilms.2015.14

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