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Nov 27, 2023

Leistung und Reproduzierbarkeit der 13C- und 15N-Hyperpolarisation unter Verwendung eines Kryogens

Wissenschaftliche Berichte Band 12,

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 11694 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Beschrieben werden der Aufbau, die Betriebsabläufe und die Leistung eines kryogenfreien Geräts zur Herstellung hyperpolarisierter Kontrastmittel mithilfe der auflösungsdynamischen Kernpolarisation (dDNP) in einem präklinischen Bildgebungszentrum. Die Polarisation wurde mithilfe des DNP-verstärkten Festkörper-NMR-Signals optimiert, um die Probenposition, die Mikrowellen- und NMR-Frequenz sowie die Leistung und den Flipwinkel zu kalibrieren. Die Polarisation einer Standardformulierung, um ~ 4 ml, 60 mM 1-13C-Brenztraubensäure in einer wässrigen Lösung zu ergeben, wurde in fünf Experimenten zu P(13C) = (38 ± 6) % (19 ± 1) s nach der Auflösung quantifiziert. Die monoexponentielle Zeitkonstante des Aufbaus der Festkörperpolarisation wurde auf (1032 ± 22) s quantifiziert. Wir haben einen Arbeitszyklus von 1,5 Stunden erreicht, der das Laden der Probe, die Überwachung des Polarisationsaufbaus, die Auflösung und die Vorbereitung für den nächsten Lauf umfasst. Nach Injektion des Kontrastmittels in vivo wurden Pyruvat, Pyruvathydrat, Laktat und Alanin durch Messung von Metabolitenkarten beobachtet. Basierend auf dieser Arbeitssequenz wurde hyperpolarisierter 15N-Harnstoff erhalten (P(15N) = (5,6 ± 0,8) % (30 ± 3) s nach Auflösung).

Die Magnetresonanztomographie (MRT) hat die moderne Diagnostik revolutioniert, indem sie hochauflösende anatomische und funktionelle 3D-Bildgebung ohne ionisierende Strahlung ermöglicht1,2. Viele der biochemischen Prozesse in vivo unterliegen jedoch noch immer unseren besten Bemühungen, und der Zugriff auf diese Prozesse bleibt ein vorrangiges Ziel vieler Forschungsarbeiten.

Hier sind hyperpolarisierte Kontrastmittel vielversprechend, da sie einen einzigartigen Einblick in den Stoffwechsel bieten, nicht-invasiv und in vivo. Durch die Verstärkung des Signals ausgewählter, oft endogener Moleküle kann ihr Schicksal – für eine begrenzte Zeit – mit hoher räumlicher und chemischer Auflösung verfolgt werden. Diese Eigenschaften ermöglichten die Identifizierung von Krebsgewebe, bevor ein Tumor sichtbar wurde, und trugen dazu bei, das Ansprechen auf die Behandlung zu überwachen.

Dissolution dynamic nuclear polarization (dDNP) 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 10158–10163 (2003)." href="/articles/s41598-022-15380-7#ref-CR3" id="ref-link-section-d1848662e516"> 3 ist die etablierteste Technik zur Hyperpolarisierung (HP) von Biomolekülen für die In-vivo-Bildgebung und ist nur mit hyperpolarisiertem Xenon6 auf den Menschen anwendbar4,5. Andere HP-Techniken umfassen Brute-Force7, Parawasserstoff-induzierte Polarisation8, chemisch induzierte dynamische Kernpolarisation9 und für Edelgase optisches Spin-Austausch-Pumpen10,11.

dDNP hat es ermöglicht, Biomoleküle in etwa einer Stunde zu mehr als 50 % zu polarisieren12,13. Die Kernpolarisierung des Targets wird erreicht, indem zuerst der Elektronenspin polarisiert wird, wobei niedrige Temperaturen (≈ 1,4 K) und hohe Magnetfelder (≈ 6,7 T) verwendet werden. Anschließend wird die Elektronenpolarisation durch die Wechselwirkungen zwischen Elektronen- und Kernspin unter Einwirkung elektromagnetischer Wellen in eine Kernpolarisation umgewandelt, die mit einer Frequenz übertragen werden, die der Differenz der Larmorfrequenzen der beiden beteiligten Elektronenspins entspricht14. Die ungepaarten Elektronenspins werden in Form stabiler Radikale hinzugefügt: TEMPO15, TEMPOL oder Tritylradikale16,17 oder durch UV-Strahlung induziert18. Darüber hinaus gibt es weitere Arten von Musterrezepturen, beispielsweise HYPOP19.

Wenn der gewünschte Grad der Kernspinpolarisation erreicht ist, wird die gefrorene Probe schnell geschmolzen, aufgelöst und durch unter Druck stehendes, überhitztes Wasser aus dem Polarisator ausgestoßen, sodass ein injizierbares Kontrastmittel entsteht.

Overall, dDNP is a complex process combining nuclear magnetic resonance (NMR) electron spin resonance (ESR), radical chemistry, high magnetic fields, fast dissolution, and cryogenictemperatures. Making this process available for biomedical research routinely is not straight forward. Over the last decades, several experimental implementations of dDNP were presented such as a cryogen-consumption-free DNP 9.4 T polarizer20, a 129-GHz dynamic nuclear polarizer in an ultra-wide bore superconducting magnet21, a Dynamic Nuclear Polarization Polarizer for sterile Use Intent22 and a multisample 7 T dynamic nuclear polarization polarizer for preclinical hyperpolarized MR23. Moreover, a number of dDNP polarizer were commercialized: HyperSense by Oxford Instruments 10,000 times in liquid-state NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 10158–10163 (2003)." href="/articles/s41598-022-15380-7#ref-CR3" id="ref-link-section-d1848662e608">3, SpinLab von GE und SpinAligner von Polarize24.

Hier präsentieren wir unsere ersten Erfahrungen mit dem neuesten Mitglied der Familie, einem kryogenfreien Auflösungspolarisator für präklinische Anwendungen (SpinAligner, Polarize, Dänemark)24. Wir berichten über die Installation des Gerätes und die Routine zur 13C- und 15N-Hyperpolarisation. Durch die Implementierung routinemäßiger Betriebsabläufe wurde eine hohe und reproduzierbare Polarisation erreicht.

Der in dieser Arbeit verwendete Polarisator (SpinAligner, Polarize, Dänemark) ähnelt einem 201924 beschriebenen Aufbau, verfügt jedoch über einen anderen Magneten (6,7–10,4 T) und ein anderes Auflösungsmodul. Die Hauptkomponenten sind ein kryogenfreier, supraleitender Magnet, der durch einen Heliumkryostaten mit geschlossenem Kreislauf gekühlt wird, ein variabler Temperatureinsatz (VTI), eine Mikrowellenquelle, ein NMR-Spektrometer, ein Auflösungsmodul und Steuersoftware (Abb. 1, 2). . Der supraleitende Magnet wurde mit einem 230 V/10 A Netzteil betrieben, um max. 9,4 T (anstelle von 10,4 T wie im Jahr 201924 beschrieben) und wurde hier mit ~ 6,7 T verwendet. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass der Flüssigkeitsweg zur Auflösung für präklinische und In-vitro-Anwendungen optimiert ist.

Foto (a,b) und Diagramm (c) des in dieser Arbeit verwendeten Polarisators. Der Polarisator besteht aus einem auf dem Magneten montierten Auflösungsmodul (a) (Abschnitt b, magentafarbenes Quadrat) und einem Gestell für Hilfsteile. Das Auflösungsmodul (a) enthält einen Einlass für das Auflösungsmedium (DM), eine Heizung für DM (5), einen Swagelok-Verteiler (1–4), ein Schaltventil (6), den Probenbecher und einen Auslass. Der Magnet (b-Abschnitt, magentafarbenes Quadrat) ist mit einem variablen Temperatureinsatz (VTI) ausgestattet, der durch Evakuieren eines Bades aus flüssigem Helium am Boden des VTI auf 1,4 K abgekühlt wird. Der Heliumgasdruck im VTI und im Einlass wird von den Monitoren P1 (8) bzw. P2 angezeigt. Die DNP-Sonde im Inneren des VTI besteht aus einem Tunnel für den Probenbecher, einem Wellenleiter zur Übertragung der Mikrowellen und einer NMR-Spule am Boden. Die Probe wird über eine Luftschleuse (7) oben in das VTI eingeführt. Das Rack dient zur Unterbringung der Pumpe, die das Helium des VTI umwälzt, eines NMR-Spektrometers, der Magnetstromversorgung, der Temperaturregler und der Benutzeroberfläche. Abbildung c zeigt eine schematische Ansicht des Polarisators mit Nennung aller Hauptkomponenten.

Zeichnungen des dDNP-Systems mit Angabe der Abmessungen, des Streumagnetfelds (gestrichelte Linien) und des Bedienbereichs (rote Linie). (Zeichnungen werden mit Genehmigung aus dem SpinAligner-Benutzerhandbuch reproduziert).

Zur Hyperpolarisierung wurden ca. 22 mg einer Formulierung, die das Radikal und konzentriertes Kontrastmittel enthielt, in einen Probenbecher (PEEK, maximales Füllvolumen beträgt 400 µL) gefüllt, in den Magneten abgesenkt und polarisiert. Sobald die gewünschte Polarisation erreicht war, wurde die Probe aufgelöst, ausgestoßen und durch Einspritzen eines überhitzten Lösungsmediums in den Becher verdünnt. Der Becher wurde über eine Einweg-O-Ring-Dichtung mit dem Flüssigkeitssystem des Polarisators verbunden, über eine Luftschleuse in den VTI eingeführt (Abb. 1) und über einen zentral gesteuerten Mechanismus in den Magneten abgesenkt. Im VTI wurden durch Anpumpen eines flüssigen Heliumbades Temperaturen unter 1,5 K erreicht. Das Helium wurde aus einem 50-L-Speicherzylinder in den geschlossenen Kühlkreislauf gepumpt, um das Heliumbad nach der Kondensation am Magnet-Kryokühler wieder aufzufüllen. Es kehrt durch einen Aktivkohlefilter (im Inneren des Magnetgehäuses) zum Tank zurück. Zur Steuerung der Heliumzufuhr zum VTI wurde ein Nadelventil verwendet, und die Volumina wurden so gewählt, dass sie den atmosphärischen Druck nie überschreiten, um die Sicherheit zu gewährleisten. P1- und P2-Monitore zeigen den He-Druck im Inneren an des VTI bzw. direkt außerhalb des He-Tanks. Die Temperatur der Probe wurde durch einen keramischen Thermistor an der Außenseite des Kupfer-Mikrowellenhohlraums geschätzt und der Druck im VTI unterhalb der Luftschleuse gemessen.

Ein NMR-Spektrometer (Cameleon, Spinit, RS2D) wurde mit einer Alderman-Grant-Spule im VTI verbunden, um das NMR-Signal vor Ort zu erfassen. Die Frequenz und Impedanz der NMR-Sonde wurden mithilfe variabler Kondensatoren einer LC-Schaltung in einer Aluminiumbox außerhalb der Bohrung eingestellt. Durch Anpassen oder Austauschen der Schaltung konnten 1H-, 13C-, 15N-, 63Cu- oder 129Xe-Signale erfasst werden.

Eine Mikrowellenquelle mit einer maximalen kontinuierlichen Ausgangsleistung von 100 mW sorgte für eine konstante oder frequenzmodulierte25 Bestrahlung der Probe im VTI, wie von der Steuersoftware eingestellt.

Alle Vorgänge wurden von einer zentralen Software und Digital-Analog-Wandlern (Polarize; LabVIEW, National Instruments) gesteuert. Insbesondere wurden die Daten von mehr als 4 Sensoren ständig überwacht und komprimiert gespeichert.

Das dDNP-System wurde in der Nähe eines 7-T-MRT (30 cm Bohrung, BioSpec 70/30, Bruker), zweier 1-T-Tisch-NMR-Spektrometer (Spinsolve Carbon and Nitrogen, Magritek) und eines hochauflösenden 9,4-T-Wide-Bore-NMR aufgebaut Spektrometer (9 cm Bohrung, WB400, Avance NEO, 5 mm BBFO-Sonde, Bruker). Nach der Installation wurde eine Reihe von Kalibrierungen durchgeführt (Tabelle 2).

Alle Informationen zum Standardmuster sind dem SpinAligner-Benutzerhandbuch entnommen.

Eine allgemeine, schrittweise Beschreibung der Herstellung von Kontrastmittel (CA)-Radikalkonzentraten finden Sie in Tabelle 1; Die Vorgehensweise speziell für Pyruvat ist in Tabelle 4 aufgeführt und kann für andere Stoffe angepasst werden.

Im Allgemeinen wurde jeweils eine größere Menge (z. B. 1,5 g) CA-Radikalkonzentrat hergestellt, in kleinere Aliquots (z. B. 250 mg) aufgeteilt und bei −22 °C gelagert. Für ein DNP-Experiment wurde eine dieser Chargen erwärmt und die gewünschte Menge entnommen (z. B. 22 mg).

Alle Experimente wurden mit Tritylradikal (AH111501, Molekulargewicht 1595 g/mol, POLARISIEREN) und einem der unten beschriebenen Kontrastmittel durchgeführt.

Etwa 1,5 ml Brenztraubensäureradikalkonzentrat wurden hergestellt und in 250-µl-Aliquoten bei –24 °C eingefroren, enthaltend 30 mM Tritylradikal und 14 M 1-13C-Brenztraubensäure (Tabelle 2 1-13CPA, Molekulargewicht 89,05 g/mol, Sigma). -Aldrich, CAS: 99124-30-8). Für jedes dDNP-Experiment wurde ein Aliquot aufgewärmt und die angegebene Menge des Konzentrats entnommen (typischerweise 22 mg).

51 mg Tritylradikal und 250 mg 13C,15N2-Harnstoff (Molekulargewicht 60,05 g/mol, Sigma-Aldrich, CAS: 58069-83-3) wurden in 500 mg entionisiertem Wasser und 500 mg Glycerin (G7893-500) gelöst ml, MW 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5, Sigma-Aldrich). Das resultierende Konzentrat enthielt 35,5 mM Tritylradikal und 4,62 M Harnstoff und wurde bei –24 °C gelagert. Für jedes DNP-Experiment wurde die angegebene Menge des Konzentrats (typischerweise 54 mg) aus der Stammlösung entnommen und in den Probenbecher überführt.

51 mg Tritylradikal und 250 mg [1,3-15N] Harnstoff (Molekulargewicht 60,05 g/mol, Sigma-Aldrich, CAS: 2067-80-3) wurden in 500 mg entionisiertem Wasser und 500 mg Glycerin gelöst (G7893-500 ml, MW 92,09 g/mol, CAS: 56-81-5, Sigma-Aldrich). Das resultierende Konzentrat enthielt 35,5 mM Tritylradikal und 4,62 M Harnstoff und wurde bei –24 °C gelagert. Für jedes DNP-Experiment wurde die angegebene Menge des Konzentrats (typischerweise 54 mg) aus dem Vorrat entnommen und in den Probenbecher gefüllt.

Das Auflösungsmedium wurde durch Mischen von 1,51 g voreingestellten Trizma-Kristallen (pH 7,6, durchschnittliches Molekulargewicht 149,0 g/mol Sigma-Aldrich, T7943) zur Pufferung der Probe, um einen End-pH-Wert nahe 7 zu erhalten, und 27 mg Ethylendiamintetraessigsäure hergestellt (EDTA, SERVA, CAS: 9002-07-7), 0,756 g NaCl (Sigma-Aldrich) und 0,81 g NaOH (Sigma-Aldrich, CAS: 1310-73-2) in 250 ml entionisiertem Wasser und bei gelagert − 20 °C. Typischerweise wurden 3,9 ml für ein Experiment verwendet. Für die Harnstoffexperimente wurde stattdessen nur H2O mit 0,27 mM EDTA verwendet.

Wie im SpinAligner-Handbuch angegeben, wurde die magnetische Feldstärke nach dem Hochfahren des Magneten durch Erfassen des Festkörper-63Cu-NMR-Signals der NMR-Spule (B0 = 2π ν63Cu/γ63Cu) bestimmt, wobei ν63Cu die Frequenz der 63Cu-Resonanz ist und γ63Cu/2π = 11,319 MHz/T ist sein magnetogyrisches Verhältnis. Mit B0 wurden die Frequenzen von 13C, 15N, 129Xe und e- entsprechend berechnet (νx = B0 γx/2π) (siehe andere γx-Werte in SI). Eine feinere Kalibrierung der Frequenzen wurde anhand des NMR-Signals der Kerne durchgeführt.

Im Folgenden ist NA die Anzahl der Mittelwerte pro Spektrum, NS die Anzahl der Scans pro Spektrum, NX die Anzahl der Anregungen innerhalb der TR-Periode, TR die Wiederholungszeit und TX die Zeit zwischen zwei aufeinanderfolgenden Anregungen innerhalb einer Impulsreihe . Als wir NMR-Spektren mit DNP (Spinit, RS2D) gemessen haben, verwendeten wir oft NS = 1 oder 4, mit TX < TR; Die üblichen Parameter waren TX = 217 µs und TR von 1 Minute bis 1 Stunde. Als wir NMR-Spektren mit NMR-Spektrometern gemessen haben, war NS 1, daher TX = TR.

Der HF-Flipwinkel α wurde mithilfe einer Folge von Anregungen mit geringem Flipwinkel an einer DNP-verstärkten Probe kalibriert. 490 Anregungen wurden in 10 s angewendet (TR = 1 s, TX = 217 µs, NX = 49, NS = 1), was zu einer durchschnittlichen Anzahl von Anregungen pro Sekunde N = NX/TR = 49 s−1 führte. Jeder 49. freie Induktionszerfall (FID) wurde aufgezeichnet und verarbeitet. Dann haben wir eine monoexponentielle Zerfallsfunktion an die Daten angepasst.

(Eine ausführliche Beschreibung dieses Ansatzes wird von Elliott et al. illustriert.)26.

Wir werden dieselbe Funktion verwenden, um den Polarisationsabfall im flüssigen Zustand anzupassen, um das scheinbare \(T_{1}^{obs}\) zu erhalten (weiter unten ausführlicher erklärt).

Unter der Annahme, dass sich die Polarisation im Verlauf des Experiments nicht wesentlich entspannte, konnten wir den angewendeten Flipwinkel ermitteln (Gleichung 2, Details in SI):

Dabei ist S(t) das zum Zeitpunkt t erfasste Signal, S0 das Anfangssignal, \({\uptau }\) die angepasste Konstante, NX die Gesamtzahl der Anregungen pro TR-Periode, N die Zahl der Anregungen pro Sekunde .

Unter der Annahme der Linearität des HF-Leistungsverstärkers wurde diese Kalibrierung verwendet, um den Anregungswinkel für andere Dauern \(p_{d}^{RF}\) oder die Leistungsdämpfung \(p_{a}^{RF}\) (in dB) festzulegen. Verwenden der Einstellungen für den kalibrierten Winkel:

Der Polarisationstransfer von Elektronen zu Kernen wurde optimiert, indem das DNP-verstärkte 13C- oder 15N-NMR-Signal als Funktion der Mikrowellenleistung (in W) erfasst wurde. \(p_{w}^{{{\mathbf{\mu W}} }}\) (gemeinsames Inkrement von \(p_{w}^{{{\mathbf{\mu W}}}}\) betrug 5 mW) und Frequenz νµW (gemeinsames Inkrement von νµW betrug 10 MHz). Nach 1–2 Minuten Mikrowellenbestrahlung wurde das Festkörper-13C- (oder 15N)-NMR-Signal des DNP-polarisierten CA-Radikalkonzentrats unter Verwendung eines konstanten 2°–5°-Anregungsimpulses für verschiedene Einstellungen der µW-Frequenz oder -Leistung gemessen. Nach jeder Erfassung wurden eintausend Impulse mit demselben Flipwinkel angelegt, um die verbleibende Polarisation zu sättigen.

Ein Pyruvat-Radikal-Konzentrat wurde 40 Minuten lang polarisiert und an verschiedene Positionen im VTI bewegt, wo ~ 2° 13C-Spektren aufgenommen wurden.

Um das Festkörper-13C-NMR-Signal im thermischen Gleichgewicht im Polarisator zu erfassen, wurden 247,9 mg Pyruvatradikalkonzentrat (30 mM Tritylradikal und 14 M 1-13C-PA) hergestellt und stündlich bei ≈ 1,4 K in die Sonde eingeführt , wurden mehrere 13C-NMR-Spektren mit niedrigem Flipwinkel aufgenommen, um zu überwachen, wie die Magnetisierung das Gleichgewicht erreicht (\(\alpha\) ~ 0,32°, \(p_{d}^{RF}\) = 2 us, \(p_{a }^{RF}\) = 38 dB, NS = 256, TS = 217 us und TR = 1 h). Die Daten wurden exportiert und offline verarbeitet (Basislinie, Phasenkorrektur, Nullfüllung auf 4096 und Integration, MestReNova). Eine monoexponentielle Erholungsfunktion (Gleichung 4) wurde an die Daten angepasst, um das scheinbare Gleichgewichtssignal \(S_{inf}^{\alpha }\) und die scheinbare Festkörper-Erholungszeit \(T_{1}^) zu erhalten {obs}\):

Unter Kenntnis des Anregungswinkels \(\alpha\) und der Anzahl der Anregungen pro Sekunde \(N\) schätzten wir die tatsächliche Relaxationszeit und das Gleichgewichtssignal (Einzelheiten siehe SI) als

\(S_{inf}\) ist das Gleichgewichtssignal, wenn das vollständige Gleichgewicht des Signals ohne HF-Anregungen erreicht ist und wie zuvor \(N = NX/TR\) (Gl. 2).

Der Aufbau der DNP-verstärkten Festkörperpolarisation wurde in situ unter Verwendung von \(\alpha \cong 0,7^\circ\)-Anregung mit NS = 4 für 13C-DNP und etwa 3,5° für NS = 1 für 15N überwacht -DNP. Die Signale S(t) wurden automatisch integriert und auf dem Polarisator zusammen mit einer an die Daten angepassten exponentiellen Wiederherstellungsfunktion angezeigt. Für eine detailliertere Analyse wurden die Spektren offline verarbeitet (Nullfüllung, Basislinienkorrektur, Phasenkorrektur, Integration; MestReNova). Eine monoexponentielle Wiederherstellungsfunktion (Gleichung 5) wurde an die Daten angepasst, um die Aufbaukonstante TDNP zu erhalten, wobei der Effekt des Flipwinkels berücksichtigt wurde (Gleichung 6).

Die DNP-Signalverstärkung ε der Feststoffprobe im Polarisator wurde anhand der Signalintensitäten der thermisch und hyperpolarisierten Spektren unter Berücksichtigung der Aufnahmeparameter berechnet (Gl. 8).

wobei S die Integrale über entsprechende NMR-Signale sind, \(NS_{{{\text{acq}}}}^{TP}\) und \(NS_{{{\text{acq}}}}^{HP}\ ) sind die Anzahl der Scans für die thermisch und hyperpolarisierte Probe, und \(\alpha_{HP}\) und \(\alpha_{TP}\) sind die Anregungs-Flipwinkel, die zur Erfassung der hyperpolarisierten bzw. thermischen Spektren verwendet werden. \(RG_{TP}\) und \(RG_{HP}\) sind Werte der linearen Empfängerverstärkungen (zu beachten ist, dass die Korrekturwerte von T1 und S in SI angezeigt werden).

Die absolute Polarisation wurde durch Multiplikation der Verstärkung mit der thermischen Polarisation (\(P^{{{\text{TP}}}}\, Gleichung (9)) berechnet: PTP(13C) (1 T, 295 K) = 0,8711 ppm, PTP(13C) (6,65 T, 1,4 K) = 1220 ppm, PTP(13C) (9,4 T, 295 K) = 8,187 ppm, (15N)PTP(15N) (9,4 T, 295 K) = 3,3 ppm.

Dabei ist \(\hbar\) die reduzierte Planck-Konstante, ε der Verstärkungsfaktor, kB die Boltzmann-Konstante, B0 das Magnetfeld und T die Temperatur.

Das Flüssigzustands-NMR wurde entweder durch ein 1-T-Tisch-NMR (Spinsolve Carbon, Magritek) oder ein hochauflösendes 9,4-T-NMR (WB400, Avance NEO, 5 mm BBFO-Sonde, Bruker) erfasst. Die 13C- oder 15N-Signalintensitäten wurden mithilfe automatischer Basislinie und manueller Phasenkorrektur vor der numerischen Integration quantifiziert (der Integrationsbereich um das Signal betrug ± 1 ppm bei 9,4 T und ± 2 ppm bei 1 T unter Verwendung von TopSpin oder MestReNova).

Um die Aufnahme von 13C-NMR thermisch polarisierter Proben bei 1 T zu beschleunigen, wurden 4 Vol.-% Gd-Kontrastmittel hinzugefügt ([Gd], 1 mmol/ml, Gadovist, Bayer). Wir verwendeten Mittelwerte von 3600, einen Flipwinkel von 20 °, TR = 2 s und RG = 31 (beachten Sie, dass dasselbe RG verwendet wurde, um Flüssigzustands-NMR-Spektren der hyperpolarisierten Lösung zu erfassen). Die geschätzte T1 betrug 50 ms.

Um ein thermisch polarisiertes 13C-Signal bei 9,4 T zu erhalten, verwendeten wir einen einzelnen Scan mit einem Flipwinkel von 90° mit RG = 101, 20 Minuten nach der Auflösung (RG = 0,25 für NMR-Spektren im flüssigen Zustand der hyperpolarisierten Lösung).

Für die 15N-NMR wurden 3 Vol.-% [Gd] hinzugefügt und 128 Aufnahmen nach einem 90°-Flip-Winkel wurden bei 9,4 T mit TR = 17 s erfasst. Bei 1 T wurde in 100.000 Mittelwerten und TR = 2 s kein thermisches 15N-Signal beobachtet.

Die hyperpolarisierten Spektren wurden nach manueller Übertragung auf das jeweilige Gerät sequentiell mit einer festen Wiederholungszeit TR und einem konstanten Flipwinkel \(\alpha_{HP}\) aufgenommen.

Um die Lebensdauer der Hyperpolarisation \(T_{1}^{HP}\) zu quantifizieren, wurde eine monoexponentielle Zerfallsfunktion an die Daten angepasst, was \(T_{1}^{obs}\) ergab (Gleichung 1). \(T_{1}^{obs}\) wurde unter Berücksichtigung der durch die wiederholten HF-Anregungen verbrauchten Polarisation unter Verwendung von Gleichung korrigiert. (6) (Gleichung 6, siehe Details in SI).

Die Signalverstärkung \(\varepsilon\) und die absolute Polarisation P wurden in Bezug auf das (gemittelte) Signal der thermisch polarisierten Proben unter Verwendung der Gleichungen 5 und 7 quantifiziert.

Beachten Sie, dass alle hier gezeigten Experimente ohne Hintergrundsubtraktionen analysiert wurden.

Zwei männliche FVB.TgN(Ela1KRAS.G12D)9EPS.CEABAC wurden in der Zentralen Tierstation des Universitätsklinikums Schleswig-Holstein, Kiel, Deutschland, gezüchtet. Die Tiere wurden im Alter von ca. 9 Monaten gemessen und hatten ein Gewicht von ca. 35 g. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem deutschen Tierschutzgesetz durchgeführt. Der Tierschutzausschuss der Kommunen (Ministerium für Energie, Landwirtschaft, Umwelt, Natur und Digitalisierung Schleswig-Holstein (MELUND)) hat alle Versuche genehmigt (V242-18779/2021(2-1/21)).

Die Berichterstattung über diese Studie erfolgt in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien.

Ein Mausmodell für einen spontanen Pankreastumor wurde durch intraperitoneale Injektion von 75 mg/kg Ketamin und 0,5 mg/kg Medetomidin anästhesiert. Das Anästhetikum wurde 1:5 mit 0,9 % NaCl verdünnt, was 155 µl Lösung pro Maus ergab. Zur Injektion von 200 µL HP 1-13C-PA-Lösung wurde ein Schwanzvenenkatheter verwendet. Während der In-vivo-Messungen wurden die Tiere über das Bett erwärmt und die Vitalparameter der Tiere kontinuierlich überwacht. Nach den MRT-Messungen (~ 1 h) wurden die Tiere eingeschläfert, ohne dass sie durch eine Zervixluxation aufwachten. Die Bilder wurden mit einem 7 T, 30 cm MRT-System (Biospec 70/30, Avance Neo, Bruker, Deutschland) aufgenommen, das mit einer zylindrischen, doppelt abgestimmten 1H-/13C-Volumen-Sendespule (72 mm Durchmesser und 100 mm Länge) ausgestattet war und flexible 13C-Oberflächen-Empfangsspule (20 mm Durchmesser, RAPID biomed, Deutschland)).

Zur anatomischen Referenz wurde ein T2-gewichtetes 1H 2D RARE MRT aufgenommen (Aufnahmezeit = 76,5 s, TR = 0,75 s, TE = 13 ms, 256 × 256 Matrixgröße und Sichtfeld FOV = 33 mm × 33 mm, 9 Schichten mit Schichtdicke = 4,26 mm, Flipwinkel 90°/180°).

Das 2D-chemische Verschiebungsbild (CSI) mit freiem Induktionszerfall wurde alle 5 s acht Mal hintereinander aufgenommen (Aufnahmezeit = 5 s, TR = 44,62 ms, TE = 0,489 ms, 11 × 11-Matrixgröße, FOV = 33 mm). × 33 mm, Einzelschicht, Schichtdicke = 4,26 mm, Flipwinkel 5°)27,28,29.

13C-CSI-Bilder wurden mit einem von der Gruppe um Franz Schilling entwickelten Skript (Matlab) verarbeitet.

Der Polarisator ist mobil, auf Rädern montiert (Abb. 1) und wurde in einem Abstand von 3 m vom präklinischen 7-T-MRT, 2 m von zwei 1-T-Tisch-NMR-Spektrometern und 5 m vom 9,4-T-NMR platziert. Der Aufbau war mit einer 1-Phasen-Steckdose (10 A), getrockneter und unter Druck stehender Luft (Atlas Copco 8F1-Luftkompressor) und Heliumgas aus einer 50-l-Flasche (Reinheit 5,0, Air Liquide) ausgestattet. Der Heliumkompressor zur Kühlung des Magneten wurde über eine 20 m lange Heliumleitung im Abstand von 9 m installiert. Der He-Kompressor benötigt Kühlwasser und dreiphasigen Strom (F-70H, Sumitomo).

Der Magnet wurde evakuiert (Vakuumpumpe HiCube 80 Classic, Pfeiffer Vacuum), bevor der He-Kühler mit geschlossenem Kreislauf eingeschaltet wurde (empfohlener Druck < 1 × 10−4 mbar). Als eine Temperatur von 1,5 K erreicht wurde (berechnet aus dem Druck des VTI-Auslasses), wurde das Zielfeld von 6,7 T in der Polarisator-Benutzeroberfläche eingestellt und der Magnet wurde in ~ 30 Minuten auf I = 72,811 A hochgefahren (mit eine Werkskalibrierung). Die Stabilisierungsphase dauerte etwa 20 Minuten.

Das 63Cu-NMR-Signal der NMR-Spule im VTI wurde bei ν63Cu = 75,259 MHz unter Verwendung von 4 Mittelwerten und einem Flipwinkel von 32° (\(p_{a}^{RF}\) = − 2 dB, \(p_{ d}^{RF}\) = 2 µs, siehe SI, Abschn. 4.1.), was zu B0 = 6,6489 T, 13C-Frequenz ν13C = 71,197 MHz und Elektronen-Larmorfrequenz νe− = 186,397 GHz führt. Die Halbwertsbreite (FWHM) des 63Cu-Signals betrug 0,25 MHz (das gesamte Kalibrierungsverfahren ist im SpinAligner-Handbuch beschrieben).

Für eine feinere Kalibrierung der Kohlenstoffresonanzfrequenz wurden ~ 22 mg des Pyruvatradikalkonzentrats (30 mM Tritylradikal und 14 M 1-13C-PA) in den Probenbecher gefüllt und auf 10 mm über dem Boden des Probenbechers abgesenkt Sonde. Nach dem Anpassen des LC-Schaltkreises wurde mit der DNP unter Verwendung einer Dauerstrich-Mikrowellenbestrahlung (\(p_{a}^{MW}\) = 16 mW und νµW = 187,135 GHz) begonnen und ein Festkörper-13C-NMR-Signal wurde bei ν13C = 71,492 MHz detektiert (4 Mittelwerte, die gleichen HF-Parameter), was zu B0 = 6,6765 T und νe− = 187,17 GHz führt. 13C-FWHM betrug 0,16 MHz.

Der empfindliche Bereich der NMR-Spule wurde durch Erfassung des DNP-verstärkten 13C-Festkörpersignals als Funktion der Probenposition bestimmt (Abb. 3a). Ein breites Maximum wurde um xs = 14 mm gemessen von der tiefsten Position (Unterseite der Sonde) gefunden. Um eine niedrige Probentemperatur sicherzustellen, haben wir für alle folgenden Experimente xS = 10 mm gewählt (innerhalb von 90 % des maximalen Signals).

Kalibrierung der Probenposition und des Flipwinkels. (a) DNP-verstärktes Festkörper-13C-NMR-Signal von Pyruvat als Funktion der Position der Probe in der Sonde. Um ein ausreichendes Signal sicherzustellen, wurde die Probe zunächst 40 Minuten lang polarisiert. Dann wurde das 13C-Signal jede Minute an verschiedenen Positionen xs unter Verwendung eines geringen Flipwinkels von 2° erfasst. Wenn man die Probe zuerst nach unten und dann nach oben bewegt, wurde ein breites Maximum um xs = 14 mm gefunden. Zur Orientierung des Auges wurden gerade Linien eingezeichnet. (b) DNP-verstärktes 13C-NMR-Signal, erfasst durch eine Folge von \(p_{d}^{RF}\) = 2 us, \(p_{a}^{RF}\) = 18 dB-Impulsen mit TX = 217 µs, TR = 1 s, NS = 1, NX = 49. Durch Anpassen einer monoexponentiellen Funktion an die Daten (rote Linie, \(\tau =\) 13,3 s, Gleichung 1) wurde der Flipwinkel bestimmt α = 3,2° (Gl. 2).

Um den 13C-Flipwinkel zu kalibrieren, wurde eine Standardprobe durch DNP polarisiert und nach dem Ausschalten der Mikrowellen (\(p_{d}^{RF}\) = 2 us) wurde eine Folge von freien Induktionszerfällen (FID) bei geringem Winkel erfasst , \(p_{a}^{RF}\) = 18 dB, TX = 217 µs, TR = 1 s, NS = 1, NX = 49, was zu N = 49 s−1 führt (Abb. 3b). Durch Anpassen von Gl. (1) zum Signal wurde die Signalabfallkonstante \(\tau =\) 13,3 s und α = 3,2° unter Verwendung von Gleichung erhalten. (2). Für viele der folgenden Experimente wurde ein Flipwinkel von ~ 0,32° verwendet (\(p_{d}^{RF}\) = 2 us, \(p_{a}^{RF}\) = 38 dB).

Um DNP, den Polarisationstransfer von Elektronen zu Kernen, zu optimieren, wurde das DNP-verstärkte Festkörper-13C-NMR-Signal des Pyruvatradikalkonzentrats mit TR = 2 min als Funktion der µW-Frequenz erfasst (Abb. 4a, 10-MHz-Schritte). , \(p_{a}^{RF} =\) 3 dB, NS = 4, mit α = 18°) und fester Leistung \(p_{w}^{{{\mathbf{\mu W}}}} \) = 30 mW. Es wurden zwei Extrema gefunden. Für die folgenden dDNP-Experimente wurde das Maximum bei 187,135 GHz gewählt. Nach jeder Erfassung wurde die Polarisation mit einer Folge von 1000 Impulsen mit einem Anregungswinkel von 18° gesättigt.

Um die µW-Leistung zu kalibrieren, wiederholten wir das Experiment, hielten die Frequenz konstant und variierten die Leistung (Abb. 4b, 5-mW-Schritte). Es wurde festgestellt, dass das 13C-Signal zwischen ≈ 5 und 15 mW steil ansteigt und ein langsam abfallendes Plateau bildet, das bei Leistungen größer als ≈ 40 mW abnimmt. Um eine Erwärmung der Probe durch µW-Bestrahlung zu vermeiden und gleichzeitig eine hohe Polarisation aufrechtzuerhalten, haben wir für die folgenden dDNP-Experimente eine Leistung von 16 mW gewählt.

Optimierung des 13C-Polarisationstransfers. DNP-verstärktes Festkörper-13C-NMR-Signal von Pyruvat bei ≈ 1,4 K als Funktion der Mikrowellenfrequenz (a, \(p_{w}^{MW}\) = 30 mW) und der Mikrowellenleistung (b, νMF ≈ 187,135). GHz). Bei Variation der Frequenz (a) wurden zwei Extrema beobachtet und das erste Maximum bei ≈ 187,135 GHz wurde für spätere Experimente ausgewählt. Beim Leistungsdurchlauf wurde festgestellt, dass das Signal bis zu 20 mW ansteigt; In den nachfolgenden Experimenten wurden 16 mW verwendet. Zur Orientierung des Auges wurden gerade Linien hinzugefügt. Die 13C-Polarisation wurde nach jeder Signalerfassung zerstört. Jeder Datenpunkt entspricht den 13C-Signalen, die nach 2 Minuten DNP erfasst wurden. Die NMR-Erfassungsparameter waren \(p_{w}^{RF} =\) 2 µs, \(p_{a}^{RF} =\) 3 dB, NS = 4 und α ≈ 18°.

Quantifizierung der Festkörperpolarisation. Festkörper-13C-NMR-Signale von 14 M 1-13C Brenztraubensäure, gemischt mit 30 mM Radikal (112,3 mg Gesamtprobengewicht), überwacht mit Anregungen mit niedrigem Flipwinkel (\(\alpha\) ~ 0,32°, NS = NX = 256). , TR = 1 h (a) oder TR = 5 min (b)) beim Erreichen des thermischen Gleichgewichts bei ≈ 1,4 K und 6,7 T (a) und während DNP (b). Blaue Quadrate zeigen die unten gezeigten Spektren (c, d). Durch Anpassen einer monoexponentiellen Erholungsfunktion (Gleichung 5) an den Polarisationsaufbau ohne µW (a) und mit µW (b) und Korrektur der HF-Anregungen (Gleichung 6) wird eine Festkörperrelaxation \(T_{ 1}^{ss} { } \ approx { }\left( {5,45{ } \pm { }0,44} \right){\text{h }}\), Signal im thermischen Gleichgewicht \({\text{signal } }S_{inf}^{ssTP } { } = { }\left( {4.07 \cdot 10^{4} \pm 0.1 \cdot 10^{4} } \right)\), DNP-Aufbauzeit TDNP = (18,396 ± 0,49) min und Gleichgewichtssignal \(S_{inf}^{ssDNP}\) = (\(2,0 \cdot 10^{7}\) ± \(0,2 \cdot 10^{6}\)) au wurden erhalten (beachten Sie, dass dieser Aufbau schneller ist als bei der Standardprobe). Die Polarisation des nach 110 min DNP erfassten Spektrums wurde zu \(P^{obs,ssDNP}\) (110 min) = \(S_{ }^{ssDNP}\)(110 min) \(P^{{ {\text{TP}}}}\)/\(S_{inf}^{ssTP }\) ≈ 64 %. Ohne HF-Anregungen wird das erwartete stationäre Signal auf \(P_{inf}^{ssDNP}\) = \(S_{inf}^{ssDNP}\) \(P^{{{\text{TP}} geschätzt. }}\)/\(S_{inf}^{ssTP }\) ≈ 61 % Die Spektren (c) und (d) sind die zuletzt gemessenen thermischen Erholungs- und DNP-Spektren (auf (a) und (b) blau markiert). Rechtecke). Die ersten sechs Datenpunkte in (a) wurden wegen des sehr niedrigen SNR für die Anpassung vernachlässigt.

Das Brenztraubensäure-Radikalkonzentrat wurde in den Becher gefüllt und auf xs = 10 mm über dem Boden des VTI bei ≈ 1,4 K abgesenkt. Während sich die Probe dem thermischen Gleichgewicht bei B0 ≈ 6,7 T und T ≈ 1,4 K näherte, betrug die thermische Temperatur 13 °C Das Signal wurde 24 Stunden lang überwacht (Abb. 1). Es wurde ein asymptotischer Signalanstieg beobachtet, und eine an die Daten angepasste monoexponentielle Erholungsfunktion (Gleichung 6) ergab eine scheinbare Festkörperrelaxationszeit \(T_{1}^{obs,ss}\) = (4,98 ± 0,40). ) h und scheinbares stationäres thermisches Signal \(S_{inf}^{obs,ssTP}\) = 3,9 × 104 (R2 = 0,969). Unter Verwendung der NMR-Erfassungsparameter (\(\alpha\) ~ 0,32°, NS = NX = 256 und TR = 1 h) und Gleichungen. (3) und (6) wurde die um die Anregung korrigierte Lebensdauer auf \(T_{1}^{ss}\) ≈ (5,45 ± 0,44) h geschätzt (Gl. 6, N = 256/3600 s). −1) und thermisch polarisiertes Signal \(S_{inf}^{ssTP }\) = 4,07 × 104 (R2 = 0,97) (Gl. 7). Am Ende wurde die thermische Polarisation mit einer Folge von 1000 Impulsen mit einem Flipwinkel von 5° gesättigt.

Als nächstes wurde DNP gestartet, indem die Mikrowellenquelle im Dauerstrichmodus unter Verwendung der oben beschriebenen optimierten Einstellungen eingeschaltet wurde. Der Aufbau des DNP-verstärkten 13C-Signals SDNP(t) wurde durch die Aufnahme eines NMR-Spektrums jede Minute überwacht (Abb. 1, die gleichen Parameter wie zuvor, jedoch mit TR = 1 min). Das letzte Spektrum, aufgenommen tDNP = 110 Minuten nach Beginn der DNP, ergab eine Festkörperpolarisation von Pobs,ssDNP = 64 %. An die Daten wurde eine monoexponentielle Erholungsfunktion angepasst, die eine scheinbare Zeitkonstante von Tobs,DNP = (18,39 ± 0,50) min ergab. Die HF-Anregungen hatten nahezu keinen Einfluss auf den Aufbau des DNP-Signals: TDNP = (18,396 ± 0,49) min, das entspricht einer Polarisation von ≈ 61 %.

Eine Standardprobe wurde wie oben beschrieben mit einer 22-mg-Probe polarisiert. Sobald die gewünschte Polarisation erreicht war, wurde das Auflösungsmedium (spezifisch für den Tracer und die Probengröße) in eine Heizkammer gefüllt (Abb. 1a-1). Die Lösung wurde erhitzt, bis ein Druck von 11 bar erreicht war, was einer Temperatur T ≈ 115 ºC entspricht. Unmittelbar bevor das Medium in den Probenbecher injiziert wurde, wurde der Becher um 8 cm angehoben, um den Einfluss der heißen Lösung auf das Heliumbad im VTI zu verringern. Die Injektion des Lösungsmediums in den Probenbecher wurde über die Software des Polarisators gestartet. Innerhalb von ca. Nach ca. 2 s wurde die Probe gelöst und durch ein doppelwandiges Schlauchsystem in das Auffanggefäß überführt (Injektion über Innenrohr, Auswurf über Außenrohr). Da es sich um heiße und unter Druck stehende Flüssigkeiten handelte, wurde Vorsicht geboten und Sicherheitsmaßnahmen ergriffen.

Um die Polarisation im flüssigen Zustand zu quantifizieren, wurde die Probe auf 5-mm-NMR-Röhrchen aufgeteilt und manuell in 1-T- und 9,4-T-NMR-Spektrometer überführt, wo die hyperpolarisierten und (später) thermisch polarisierten Signale erfasst wurden (Abb. 6). In diesem Beispiel wurde die Polarisation auf 26 % bei 1 T, 26 s nach der Auflösung, und 20 % bei 9,4 T, 30 s nach der Auflösung, quantifiziert. Die Lebensdauern der Polarisation wurden mit 67 s für 1 T und 48 s für 9,4 T gemessen. Unter Verwendung der längsten T1, die auch dem unteren Feld entspricht, schätzten wir die Polarisation zum Zeitpunkt der Auflösung auf 38 % für die gemessene Probe 1 T und ≈ 31 % für die 9,4 T-Probe. Beachten Sie, dass die Probe während des Transfers unterschiedlichen, variierenden und viel geringeren Magnetfeldern ausgesetzt war, sodass die Verwendung des Hochfelds T1 zur Schätzung der Polarisation nur eine sehr grobe Schätzung liefert.

Hochauflösende 13C-NMR-Spektren von hyperpolarisiertem (schwarz) thermisch polarisiertem (blau) 1-13C-PA, gemessen bei 1 T (a) und 9,4 T (b). (a) Das hyperpolarisierte Signal wurde in einem einzigen Scan (NSDNP = 1) nach ca. 1 Minute gemessen. 26 s nach Auflösung (\(\alpha\) = 5°, pw = 3,05 µs, pa = − 5,6 dB, SDNP = 32,38 au). Das thermisch polarisierte Signal wurde unter Zugabe von 4 Vol.-% Gd-Kontrastmittel (\(\alpha\) = 20°, pw = 12,20 µs, pa = − 5,6 dB, SDNP = 4,18 × 10−4 au) erfasst. Die resultierende Signalverstärkung für SDNP betrug 1,09 × 109 (Gl. 8) und die Polarisation = 26 % (Gl. 9, 10). (b) Bei 9,4 T wurde das Signal ≈ 30 s nach der Auflösung mit einem 5°-Puls (SDNP = 7,59 × 105 au, pw = 10 µs, pa = − 18,9 dB, RG = 0,25) erfasst und in Bezug auf quantifiziert thermisch polarisiertes Signal, erfasst mit einem einzelnen 90°-Impuls (STP = 1,41 × 105 au, pw = 0,55 µs, pa = − 18,9 dB, RG = 101) bis zu einer Verstärkung von 2,5 × 104 (Gleichung 8) und einer Polarisation von 20 % (Gl. 9, 10). Beachten Sie, dass aufgrund der Unterschiede im RG beide hyperpolarisierten Spektren auf 1 normiert wurden und das bei 1 T gemessene thermische Spektrum mit 5000 multipliziert wurde, um in die Skala zu passen.

Bei der Durchführung von mehr als 100 DNP-Experimenten erwies sich das folgende Verfahren als entscheidend, um eine reproduzierbare Polarisation für 1-13C-Pyruvat zu erhalten. Zusätzlich zu den anfänglichen Kalibrierungen während des Aufbaus (Tabelle 2) haben wir ein ausgefeilteres Verfahren entwickelt, das Routinekalibrierungen (Tabelle 3), eine spezifische Vorbereitung der Chemie (Tabelle 4), ein 21-stufiges Polarisationsverfahren (Tabelle 5) und a umfasst wöchentliche Wartungsroutine (Tabelle 6). Diese Verfahren wurden für die Pyruvatpolarisierung entwickelt, können aber als Ausgangspunkt für andere Wirkstoffe dienen (z. B. unten für 15N-Harnstoff), obwohl einige Modifikationen erforderlich sein werden.

Mit diesen Verfahren haben wir die Reproduzierbarkeit und Ausbeute für den Erhalt einer Lösung von ≈ 4 ml mit 60 mM hyperpolarisierter Brenztraubensäure bewertet, einer Zusammensetzung, die für Tierversuche geeignet ist30,31,32. Der dDNP-Prozess wurde fünfmal an verschiedenen Tagen unter Verwendung von Standardproben von (21,64 ± 0,15) mg und 3,9 ml Auflösungsmedium und Detektion bei 1 T wiederholt (Tabelle 7). Im Durchschnitt erhielten wir eine Aufbaukonstante TDNP = (1032 ± 21,7) s und eine Festkörperpolarisation von (42,1 ± 3,7) au. Abhängig von der Übertragungszeit ttrans (17–20 s) wurde die Polarisation im flüssigen Zustand in Bezug auf die thermisch polarisierte Probe auf P ≈ 33 %–46 % mit einem Mittelwert von (38 ± 5,7) % quantifiziert. Um die Polarisation direkt nach der Auflösung abzuschätzen, verwendeten wir die T1 der Proben und erhielten eine durchschnittliche Polarisation von (47,2 ± 7,8) %33. Der pH-Wert der Probe im NMR-Röhrchen wurde mit 8,51 ± 0,02 gemessen.

Zusätzlich zu den Reproduzierbarkeitsexperimenten haben wir zur Bewertung, wie viele Proben in einer bestimmten Zeit polarisiert werden können, alle etwa 90 Minuten sieben weitere 1-13C-PA-DNP-Experimente mit dem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt: Für die Vorbereitung und Reinigung waren etwa 30 Minuten erforderlich System und ca. 60 Minuten für dDNP. Im Durchschnitt wurde die gemessene Polarisation im flüssigen Zustand P(ttrans ≈26 s) = (33 ± 3,3) % erreicht, was dem geschätzten Wert direkt nach der Auflösung P(ttrans = 0) = (53,9 ± 12,4) % entspricht.

Um die Machbarkeit der metabolischen Bildgebung in vivo zu demonstrieren, haben wir 1-13C-PA mit dem oben beschriebenen Verfahren auf P(ttrans = 0) ≈ 50 % polarisiert.

Während des Aufbaus der Polarisation wurde eine CEBAC-Maus anästhesiert, mit einem Schwanzvenenkatheter ausgestattet und auf das beheizte Tierbett des 7-T-MRT-Systems gelegt. Die MRT-Spule wurde angepasst und anatomische Bilder wurden vor der Auflösung aufgenommen (Abb. 7). Im konventionellen MRT war kein Tumor erkennbar.

Hochauflösende 13C-NMR-Spektren von hyperpolarisiertem (schwarz) thermisch polarisiertem (blau) 1-13C-PA (Probe 5 in der Tabelle), gemessen bei 1 T. Das hyperpolarisierte Signal wurde in einem einzigen Scan (NSDNP = 1) nach ca. 30 Sekunden gemessen. 17 s nach Auflösung (\(\alpha\) = 5°, pw = 3,05 µs, pa = − 5,6 dB). Das thermisch polarisierte Signal wurde unter Zugabe von 4 Vol.-% Gd-Kontrastmittel (\(\alpha\) = 20°, pw = 12,20 µs, pa = − 5,6 dB, SDNP = 39,5 au) erfasst. Die resultierende Signalverstärkung für SDNP betrug 310 × 106 (Gl. 8) und die Polarisation = 43 % (Gl. 9, 10). Das gemessene thermische Spektrum wurde mit 50.000 multipliziert, um in die Skala zu passen.

Nach der Auflösung mit 5 mL Medium enthält das Kontrastmittel ca. 46 mM 1-13C-PA wurden schnell in das MRT übertragen und ≈ 100 µL wurden innerhalb von 40 s nach der Auflösung in den Schwanzvenenkatheter der Maus injiziert. Ungefähr 10 s nach dem Ende der Injektion wurde 13C-CSI über einen axialen Abdomenschnitt durchgeführt. Es wurden Signale von Pyruvat, Laktat und Alanin beobachtet und Karten für jeden Metaboliten erstellt (Abb. 8). Unter Verwendung derselben Geometrie wurde ein 1H-T1w-MRT gemessen. Wir beobachteten starke Laktat- und Pyruvatsignale in Leber und Niere. Ein hohes SNR wurde sowohl in einzelnen Voxeln als auch in größeren ROIs beobachtet.

In vivo T1w 1H-MRT, Karten von hyperpolarisiertem 1-13C-PA und 1-13C-Laktat (LA) und ausgewählte 13C-Spektren eines Pankreastumor-Rattenmodells, aufgenommen bei 7 T. Nach der Injektion von 100 µl hyperpolarisiertem Kontrastmittel mit ~ 46 mM 1-13C-PA, acht CSI-Datensätze wurden erfasst. Ein deutliches Laktatsignal wurde in den Regionen Niere (ROI1), Leber (ROI2), Aorta und Vena cava inferior (ROI3) gefunden. Im ausgewählten Voxel (blaues Rechteck) wurde ein starkes SNR beobachtet, das Resonanzen von Laktat, Pyruvat und Alanin (Ala) mit einer Linienbreite von ca. 84 Hz. Die Nur-Empfangs-Schleifenspule wurde ventral positioniert (gelbes Rechteck) und ein kleiner mit Wasser gefüllter Behälter wurde in die Mitte der Spule gestellt (grünes Rechteck, Phantom – Pha). Beachten Sie, dass die Rohre, die das Tierbett mit warmem Wasser versorgen, aufgrund von Aliasing oben erschienen. Dargestellt ist die Summe von acht aufeinanderfolgenden Akquisitionen.

Durch den Austausch der LC-Box konnten wir die Resonanzfrequenz der NMR-Spule im Polarisator auf ≈ 28,83 MHz einstellen, die Resonanzfrequenz von 15N bei 6,7 T. Dadurch konnten wir den 15N-Flipwinkel, die µW-Frequenz und die Leistung mit einem 200 mg kalibrieren Probe aus 4,16 mM 13C,15N2-Harnstoff und 35,7 mM Radikal (α = 3,5° bei pw = 3 us, pa = 10 dB, ν(µW) = 187,18 GHz, p(µW) = 35 mW). Ein DNP-verstärktes Festkörper-15N-NMR-Signal war leicht zu beobachten und eine Aufbaukonstante TDNP = (2140 ± 391) s wurde für 13C,15N2-Harnstoff und (3358 ± 425) s für 15N2-Harnstoff erhalten.

Die Auflösung erfolgte mit 5 ml entionisiertem H2O und 0,27 mM EDTA, was nach der Auflösung zu einer nominellen Harnstoffkonzentration von 45,4 mM führte. Nach der Übertragung auf das 9,4-T-NMR-Spektrometer wurden 60 5°-15N-Spektren aufgenommen (TR = 3 s) und zur Berechnung von T1 und zur Quantifizierung der Polarisation verwendet. Die Lebensdauer der hyperpolarisierten Probe wurde zu T1(13C-15N-Harnstoff) = (26,3 ± 1,0) s und T1(15N-Harnstoff) = (26,1 ± 0,7) s bestimmt.

Für 13C-15N2-Harnstoff wurde eine 15N-Polarisation von (4,5 ± 0,7) % beobachtet ttrans = (30 ± 1) s nach Auflösung (n = 4) und für 15N2-Harnstoff wurde die Polarisation zu (5,6 ± 0,8) % bestimmt nach (30 ± 3) s (n = 4), beide in Bezug auf das 15N-Signal jeder Probe im thermischen Gleichgewicht (TR = 17 s, 128 Mittelwerte, RG 101, α = 90°). Die anfängliche 15N-Polarisation zum Zeitpunkt der Auflösung (ttrans = 0 s) wurde auf P(15N) (t = 0 s) = (14,7 ± 1,7) % für 13C-15N2-Harnstoff und P(15N) (t = 0) geschätzt s) = (18,4 ± 1,1) % für 15N2 Harnstoff34.

In diesem Artikel beschreiben wir unsere ersten Erfahrungen, Betriebsabläufe und Leistung eines kryogenfreien dDNP-Polarisators, der bei 6,7 T betrieben wird.

Der Polarisator benötigt ca. 2–3 m2 Stellfläche, standardmäßigen einphasigen Strom, Druckluft und Helium. Der Magnet ist nicht aktiv abgeschirmt, daher muss auf Sicherheit geachtet werden und ein gewisser Abstand zu anderen Geräten eingehalten werden. Der Heliumkompressor benötigt 3-Phasen-Strom und Kühlwasser; Voraussetzungen, die wahrscheinlich von vielen NMR- oder MRT-Anlagen erfüllt werden. Der Lärm der Heliumpumpe am Polarisator und am Kryoexpander kann für diejenigen, die längere Zeit in der Nähe arbeiten, störend sein.

Zu den Hauptgefahren des Aufbaus zählen heiße und kalte Druckflüssigkeiten: Wasser bei 115 °C und 11 bar, flüssiger Stickstoff, max. 2 bar Helium und Druckluft, Säuren und Basen, Magnetfelder (6,7 T) und Strom (230 V). Darüber hinaus sind die unter Druck stehenden Heliumleitungen, Standardgasflaschen (z. B. 200 bar) sowie etwaige chemische Gefahren zu berücksichtigen. Die Auflösung (Erhitzen, Unter-Druck-Setzen und Extrahieren) erfolgt kontrolliert hinter geschlossenen, transparenten Türen, so dass Spritz- und Splitterschutz gegeben ist (obwohl es zu keinem solchen Vorfall kam). Nach der Auflösung ist das Medium ausreichend auf ≈ 37 °C abgekühlt. Bei Bedarf kann ein Gefäß mit Eis unter das Auffanggefäß gestellt werden. Beim Einfrieren der Probe in flüssigem N2 herrschen kalte Temperaturen. Zu den Vorsichtsmaßnahmen gehört die Verwendung geeigneter Schutzausrüstung (Handschuhe, Schutzbrille).

Da der Magnet keine flüssigen Kryogene enthält, können die Sicherheitsvorkehrungen entsprechend angepasst werden. Ein Quenchrohr ist nicht erforderlich, da die Menge an gasförmigem Helium, das zum Kühlen des VTI verwendet wird, nur 50 Standardliter beträgt, obwohl im He-Kryostat mit geschlossenem Kreislauf mehr Helium vorhanden ist.

Das System bietet vollen Zugriff auf mehr als 4 Sensorwerte, die alle kontinuierlich für den späteren Abruf gespeichert werden. Wir fanden, dass dies eine hervorragende und wesentliche Funktion ist, die eine präzise Dokumentation und Rekonstruktion der Versuchsbedingungen ermöglicht. Die Softwareschnittstelle (LabView) ermöglicht die Kontrolle über viele wichtige DNP-Parameter, und neue Funktionen können vom Benutzer oder Hersteller hinzugefügt werden. Es ist jedoch zu beachten, dass die Temperatur der Probe selbst nicht direkt gemessen werden kann und durch Messung der Temperatur des VTI geschätzt wird.

Die meisten Teile sind für Reparaturen oder Modifikationen leicht zugänglich, z. B. um die Menge an hyperpolarisierter Substanz anzupassen oder um dem Gehäuse gefilterte Luft zuzuführen. Da die meisten Ventile mit Druckluft betrieben werden, wurde keine Erwärmung und kein Schmelzen der Ventile beobachtet.

Das Umschalten zwischen verschiedenen Kernen durch Abstimmung oder Austausch der LC-Schaltung war sehr praktisch für die Überwachung der Hyperpolarisation verschiedener Kerne.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Polarisationsroutinen wurde eine robuste und zuverlässige Hyperpolarisation im flüssigen Zustand erreicht: P(13C) mit (ttrans = 19 s ± 1 s) = (38 ± 6) % und einer geschätzten Polarisation bei Auflösung von P(13C) bei t0 ≈ (47 ± 7)% (Tabelle 7). Da der tatsächliche Zerfall der Probe während des Transfers durch stark variierende Magnetfelder nicht genau bekannt ist, handelt es sich bei der Polarisation zum Zeitpunkt der Auflösung um eine Schätzung. Der Aufbau der Festkörperpolarisation ergab eine Zeitkonstante von etwa 17 Minuten, was wiederholte Auflösungen mit einem Arbeitszyklus von weniger als zwei Stunden ermöglichte, der bei Bedarf weiter beschleunigt werden kann. Die gemeldeten Daten wurden erfasst, nachdem der Füllstand des flüssigen Heliums im VTI durch Eintauchen einer Scheibe in die Flüssigkeit erhöht wurde. Diese Modifikation führte zu weniger variablen Aufbauzeiten: cv(TDNP) = 2,1 % bzw. 22,8 % mit und ohne Unterlegscheibe. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass die Temperatur im VTI nicht unbedingt die Temperatur der Probe im Fläschchen sein muss.

Interessanterweise zeigte das 13C-NMR-Signal von Pyruvat in der gelösten Probe nach der Hyperpolarisierung eine relativ große Variation, cv(SlsTH) = 13,1 %. Dieses Ergebnis kann auf eine schwankende Pyruvatkonzentration hinweisen, was auf eine inhomogene Auflösung schließen lässt.

In der Literatur sind nur wenige Daten zur Reproduzierbarkeit veröffentlicht, aber die absolute Ausbeute ist mit den zuvor berichteten vergleichbar (1-13C-PA mit Tritylradikal, d. h. 36–64 %35). Natürlich wird ein schnellerer und besser reproduzierbarer Probentransfer die Aussagekraft dieser Zahlen verbessern; Ein spezielles Liefersystem wird an anderer Stelle vorgestellt.

Die Abstimmung der NMR-Spule des DNP auf andere Kerne war einfach, da der LC-Schaltkreis in einem abgeschirmten Kasten außerhalb des VTI untergebracht war. Für Resonanzfrequenzen nahe 13C (wie 129Xe) reichte es aus, die variablen Kondensatoren anzupassen. Für andere Kerne wurde ein anderer LC-Kreis verwendet. Wir haben dies anhand der Verwendung von 15N-Harnstoff nachgewiesen, dessen gyromagnetisches Verhältnis etwa 1/10 von dem von 1H und 40 % von 13C beträgt, und haben am Spektrometer eine Polarisation von 5,6 % erhalten.

Im Verlauf dieser Studie scheiterten weniger als 5 % aller Experimente. Die meisten davon traten während der Auflösung und vor Durchführung der Reinigungsverfahren auf. Zu den aufgetretenen Problemen gehörten:

Da die Röhrchen für die Auflösung eine glatte Oberfläche haben, um einen dichten Verschluss zu gewährleisten, wurde festgestellt, dass der Absenkmechanismus manchmal verrutschte. Dieses Problem konnte leicht behoben werden, indem das Einführen sanft manuell unterstützt wurde. Ein schwerwiegenderes Problem trat nach drei Wochen Dauerbetrieb auf, als wir Probleme beim Absenken der Probe in den Magneten hatten. Wir gehen davon aus, dass dies dadurch verursacht wurde, dass sich im Inneren des Röhrchens, in das die Probe eingeführt wurde, Eis bildete, möglicherweise verursacht durch kleine Lecks oder das häufige Einsetzen/Auswerfen des Probenbechers. Das Problem wurde durch Aufwärmen des VTI gelöst, daher führten wir ein wöchentliches Reinigungsverfahren durch (Aufwärmen des VTI auf ca. 180 K innerhalb von ≈ 10 Stunden und Gasevakuierung (1 Stunde) durch eine Vakuumpumpe, gefolgt von Abkühlung auf ≈ 1,4 K in ≈). 5 Std.). Dieser Vorgang kann automatisch durchgeführt werden, z. B. am Wochenende.

Um eine konsistente Festkörperpolarisation zu erhalten, erwies es sich als wesentlich, die Probe im Becher (in flüssigem Stickstoff) einzufrieren, bevor sie in den Magneten eingesetzt wurde. Auf diese Weise wurde ein Verspritzen der Probe während der Druckbeaufschlagung vermieden, so dass die Probe am Boden des Bechers blieb. Darüber hinaus kann eine Nichtübereinstimmung der (ESR- und NMR-)Senderfrequenzen und der Larmorfrequenzen (verursacht durch Drift des Magnetfelds) zu einem Polarisationsverlust führen, sodass regelmäßige Anpassungen erforderlich sind. Darüber hinaus ist es wichtig zu betonen, wie wichtig es ist, das Probenfläschchen während des Aufbaus in flüssigem He zu halten, um die Übertragung der höchsten Elektronenpolarisation sicherzustellen. Aufgrund der Beziehung zwischen Hyperpolarisation und T führt jede Temperatur über 3 K zu erheblichen Polarisationsverlusten.

Um eine fehlerhafte Auflösung zu vermeiden, war es wichtig, das Auflösungsmodul zweimal zu trocknen, indem alle Röhrchen 7–10 Minuten lang mit Druckluft gespült wurden, bevor mit dem Polarisationsvorgang durch Einführen der Probe begonnen wurde. Da die Schläuche und Verbindungsstücke zur Auflösung stark schwankenden Temperaturen und Drücken ausgesetzt waren, ist eine regelmäßige Wartung erforderlich. Bei mehr als 100 Auflösungen haben wir bisher einen Materialfehler des Auflösungspfades beobachtet (Röhrenbruch, unklare Ursache).

Offensichtlich führen unterschiedliche Zeiten und Magnetfelder während der Übertragung zu unterschiedlichen Polarisationen. Wir haben dieses Problem behoben, indem wir die NMR-Röhrchen oben auf dem Magneten gefüllt haben, wo das Feld etwa 10 mT beträgt, und indem wir einen 12 mT-Widerstandsmagneten verwendet haben, um die Probe in das 9,4-T-NMR zu übertragen. Die Verwendung von Niederfeld-NMR-Spektrometern zum Nachweis des verstärkten 13C-Signals ist vorteilhaft, da diese nahe am DNP-System platziert werden können. Die Quantifizierung der Polarisation ist jedoch schwieriger, da die Empfindlichkeit begrenzt ist und die Verwendung eines Gadolinium-Relaxierungsmittels und eine massive Mittelung erforderlich sind, um ein ausreichendes SNR des thermischen 13C zu erhalten (für 15N wurde kein Signal beobachtet).

In diesem Artikel teilen wir unsere Erfahrungen, Ergebnisse und Tipps zum Betrieb des SpinAlinger-Polarisators aus mehr als 100 Experimenten im Laufe eines Jahres.

Insgesamt erwies sich der Polarisator als zuverlässig, kompakt, einfach zu bedienen und lieferte eine hohe Polarisation. Weitere Vorteile sind das Fehlen flüssiger Kryogene, ein kurzer Arbeitszyklus und ein offener, modularer Aufbau, der beispielsweise die Überwachung von Festkörpersignalen verschiedener Kerne ermöglicht. Wir haben die Polarisation im flüssigen Zustand von 1-13C-PA nach der Auflösung auf (38 ± 5,7) % und von 15N2-Harnstoff auf (5,6 ± 0,8) % geschätzt – ausreichend für die metabolische Bildgebung, wie hier erfolgreich demonstriert wurde.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im Zenodo-Repository unter folgender Adresse verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.5957503.

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Referenzen herunterladen

Wir danken der Forschergruppe miTarget (FOR 5042), dem Graduiertenkolleg „Materialien für das Gehirn“ (GRK 2154/1-2019), dem Emmy Noether-Programm „metabolische und molekulare MR“ (HO 4604/2-2) und der DFG für die Unterstützung Förderung INST 257/616-1 (FUGG), der SFB „bulk-reaction“ (TRR 287), die Exzellenzcluster „Präzisionsmedizin bei Entzündungen“ (PMI 2167) und das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) im Rahmen des Forschungs- und Förderkonzepts e:Med (01ZX1915C) und DFG PR-1868/3-1 (TryIBD). Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel und der Medizinischen Fakultät danken wir für die Unterstützung des Molecular Imaging North Competence Center (MOIN CC) als zentrale Einrichtung für die Bildgebung in vivo. MOIN CC wurde durch eine Förderung des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und des Zukunftsprogramms Wirtschaft des Landes Schleswig-Holstein (Projekt-Nr. 122-09-053) gegründet. Darüber hinaus sprechen wir Dr. Andrea Capozzi unseren unendlichen Dank für seine Unterstützung aus. Darüber hinaus danken wir Herrn Thomas Griebenow und Prof. Dr. Rainer Herges für die UV-Vis-Spektrometermessungen zur Bestimmung der tatsächlichen Konzentration der gelösten Probe. Darüber hinaus möchten wir Polarize unseren tiefsten Dank für die ständige Unterstützung aussprechen. Wir danken Franz Schilling und Geoffrey Topping für die Bereitstellung der maßgeschneiderten Matlab-basierten Software zur Analyse und Visualisierung von 13C-CSI. Für die Bereitstellung der Software kann Franz Schilling angefragt werden. Wir danken Stephan Düwel für die Bereitstellung der Software zur Verarbeitung der CSI-Daten.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Sektion Biomedizinische Bildgebung, MOIN CC, Klinik für Radiologie und Neuroradiologie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Deutschland

Arianna Ferrari, Josh Peters, Mariia Anikeeva, Andrey Pravdivtsev, Frowin Ellermann, Kolja Them, Olga Will, Eva Peschke & Jan-Bernd Hövener

Labor für funktionelle und metabolische Bildgebung, Institut für Physik, EPFL (Ecole polytechnique fédérale de Lausanne), Lausanne, Schweiz

Hikari Yoshihara

Klinik für Radiologie und Neuroradiologie, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Deutschland

Olaf Jansen

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AF, JP, MA und AP führten die Experimente durch. AP half beim Aufbau der NMR- und MRT-Experimente. OW und EP unterstützten bei In-vivo-Experimenten. AF, JP, MA, AP und JBH haben den ersten Entwurf des Artikels geschrieben. JBH konzipierte, akquirierte und betreute das Projekt. Alle Autoren halfen bei der kritischen Überarbeitung des Artikels und stimmten der endgültigen Fassung zu.

Korrespondenz mit Arianna Ferrari oder Jan-Bernd Hövener.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ferrari, A., Peters, J., Anikeeva, M. et al. Leistung und Reproduzierbarkeit der 13C- und 15N-Hyperpolarisation mit einem kryogenfreien DNP-Polarisator. Sci Rep 12, 11694 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-15380-7

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Eingegangen: 31. Januar 2022

Angenommen: 23. Juni 2022

Veröffentlicht: 08. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-15380-7

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