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Nov 14, 2023

Neue Erkenntnisse zum Laufbahnanbau von Euglena gracilis unter Langzeit

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7123 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Ziel dieser Studie war es, die physiologischen Reaktionen von Euglena gracilis (E. gracilis) zu untersuchen, wenn sie in offenen Teichen über einen längeren Zeitraum einem halbkontinuierlichen N-Mangel (N−) ausgesetzt sind. Die Ergebnisse zeigten, dass die Wachstumsraten von E. gracilis unter der N−-Bedingung (11 ± 3,3 gm−2 d−1) um 23 % höher waren als unter N-ausreichenden Bedingungen (N+, 8,9 ± 2,8 gm−2 d−1). ) Zustand. Darüber hinaus lag der Paramylongehalt von E. gracilis im N−-Zustand bei über 40 % (Gew./Gew.) der trockenen Biomasse im Vergleich zum N+-Zustand (7 %). Interessanterweise zeigte E. gracilis nach einem bestimmten Zeitpunkt unabhängig von der Stickstoffkonzentration ähnliche Zellzahlen. Darüber hinaus zeigte es im Laufe der Zeit eine relativ kleinere Zellgröße und einen unbeeinträchtigten Photosyntheseapparat unter N−-Bedingungen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass es bei E. gracilis einen Kompromiss zwischen Zellwachstum und Photosynthese gibt, da es sich an semikontinuierliche N−-Bedingungen anpasst, ohne dass seine Wachstumsrate und Paramylonproduktivität abnehmen. Bemerkenswert ist, dass dies nach Kenntnis des Autors die einzige Studie ist, die über eine hohe Biomasse- und Produktakkumulation durch einen Wildtyp-E. gracilis-Stamm unter N−-Bedingungen berichtet. Diese neu identifizierte langfristige Anpassungsfähigkeit von E. gracilis könnte der Algenindustrie eine vielversprechende Richtung bieten, um eine hohe Produktivität zu erreichen, ohne auf gentechnisch veränderte Organismen angewiesen zu sein.

Euglena gracilis ist eine einzellige, bewegliche Süßwasseralge aus der Familie der Protisten. Seit ihrer Entdeckung in den 1660er Jahren1 hat sie große Aufmerksamkeit erregt. E. gracilis ist aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften der Plastiden- und Chloroplastenorganisation ein wichtiger Modellorganismus für das Verständnis von Photosynthesemechanismen und eukaryotischen Zellprozessen2,3. Unter aeroben Lichtbedingungen durchläuft E. gracilis Photosynthese und speichert seine Energie in Form eines Speicherpolysaccharids, unverzweigtem β-1-3-Glucan, bekannt als Paramylon3,4. Unter anaeroben Dunkelbedingungen wandelt E. gracilis das Paramylon in Wachsester um. Dabei handelt es sich um einkettige Lipide, die aus gesättigten Fettsäuren (C14:0-Myristinsäure, C16:0-Palmitinsäure und C18:0-Stearinsäure) und Alkoholen (Myristylalkohol)4 bestehen. Die Anwendungen von E. gracilis und seinen Bioprodukten (Paramylon und Wachsester) finden sich in verschiedenen Bereichen wie Ballaststoffen, Diabetesbehandlung, Verbesserung der Darmmikrobiota, Nahrungsergänzungsmitteln und Biokraftstoffen5,6,7. Aufgrund seiner vielfältigen Einsatzmöglichkeiten hat sich E. gracilis als vielversprechende industrielle Mikroalge etabliert. Mehrere algenbasierte Industrien nutzen es für die großtechnische Produktion von Nahrungsmitteln, Gesundheitsprodukten und Biokraftstoffen3.

Die Algenindustrie steht vor der ständigen Herausforderung, eine hohe Biomasse- und Bioproduktproduktivität bei niedrigen Betriebskosten zu erreichen. Obwohl Algen potenzielle Vorteile in Bereichen wie der Biokraftstoffproduktion, der Abwasserbehandlung, der Kohlenstoffabscheidung und der Eindämmung des Klimawandels bieten, bleibt ihre Produktivität seit langem ein Hindernis für die Industrie8,9,10. Obwohl die Modulation von Umweltbedingungen und Nährstoffen die Bildung von Bioprodukten verbessern kann, führt sie häufig zu einer verringerten Biomasseproduktivität7. Im Fall von E. gracilis gilt Paramylon als wertvolles Bioprodukt. Seine Anreicherung wurde unter verschiedenen Bedingungen wie Nährstoffmangel, hohem Salzgehalt, elektrischer Stimulation, Co-Kultivierung mit Bakterien und heterotropher Kultivierung beobachtet5,11,12,13,14,15,16. Forscher haben auch versucht, die Produktivität und den Paramylongehalt von E. gracilis durch genetische Modifikation zu verbessern17,18. Trotz dieser Bemühungen zur Verbesserung der Biomasse- und Bioproduktproduktion ist immer ein hoher Preis in Bezug auf Technologie oder Umweltauswirkungen zu zahlen.

Stickstoffmangel oder -limitierung (N−) ist eine kostengünstige und sichere Behandlung, um die Anreicherung von Bioprodukten in E. gracilis zu induzieren19. Die Behandlung löst Stoffwechselveränderungen aus, die die Rückführung von (photosynthetisch fixiertem) Kohlenstoff von Proteinen zu Speicherkomponenten wie Lipiden oder Stärke fördern, was zu einem Energiespeichermechanismus führt20,21,22. Allerdings ist die Biomasseproduktivität unter N−-Bedingungen im Vergleich zu Kontrollbedingungen typischerweise verringert22,23,24. Verschiedene Studien zur Stickstoffbehandlung, wie z. B. Zwischenzugabe, zweistufige, halbkontinuierliche und sequentielle Stickstoffentzugung, wurden durchgeführt, um sowohl die Biomasse- als auch die Lipidproduktivität zu verbessern25,26,27,28,29. Dennoch bedarf dieses Thema einer weiteren Erläuterung. Eine aktuelle Studie zu Chlorella mit einem zweistufigen Stickstoffmangel in Batch-Kulturen erwies sich als effiziente Methode zur Aufrechterhaltung einer lipidreichen, hohen Biomasse29. Es wurden nur wenige Studien zu E. gracilis durchgeführt, die zeigten, dass die Biomasseproduktivität des Organismus unter N-limitierten Bedingungen abnimmt29,30,31,32. Nur wenigen Studien zu gentechnisch veränderten Stämmen gelang es, unter N-Limitierungsbedingungen sowohl eine hohe Biomasse als auch eine hohe Bioproduktakkumulation zu erreichen17,33. Es sind jedoch weitere Forschungsarbeiten erforderlich, um die Effizienz der Stickstoffbehandlungsstrategie zu verbessern und gleichzeitig eine hohe Biomasse- und Bioproduktproduktivität zu erreichen.

Derzeit ist sehr wenig darüber bekannt, wie E. gracilis auf semikontinuierliche N−-Bedingungen reagiert, insbesondere über lange Zeiträume. Darüber hinaus gibt es keine Berichte über solche Studien, die in natürlichen Umgebungen mit E. gracilis durchgeführt wurden. Angesichts der Bedeutung von E. gracilis in der Industrie ist es von entscheidender Bedeutung, einen stabilen halbkontinuierlichen Anbau und eine hohe Produktivität zu erreichen34. Vor diesem Hintergrund zielte unsere Studie darauf ab, das Wachstum und die Akkumulation des Bioprodukts Paramylon in E. gracilis unter semikontinuierlichen N−-Bedingungen unter Verwendung offener Laufbahnen zu untersuchen (Abb. 1a, b). Die Ergebnisse dieser Studie könnten bei der Bewertung der Machbarkeit des Einsatzes der halbkontinuierlichen N-Kultivierung als Methode zur Kultivierung von E. gracilis für die kommerzielle Produktion in großem Maßstab hilfreich sein.

In dieser Studie verwendetes 1-m2-Anbausystem. (a) Raceway-Teichaufbau mit den Teichen R11 bis R16. R11, R14 und R15 wurden unter Kontrollbedingungen (N-ausreichend, N+) und R12, R13 und R16 unter N-armen (N−) Bedingungen gehalten. Hier stellen l, d und w des Lineals die Länge, Breite und Höhe des Teichs (in Millimetern, mm) innerhalb der Teichwand dar. Das Bild wurde am ersten Tag der Kultivierung aufgenommen. (b) Eine vergleichende Ansicht von N+- und N−-Kulturen in den Raceway-Teichen. Die Bilder wurden am fünften Tag des Experiments aufgenommen.

Die Kulturen konnten während der viermonatigen Kultivierungsperiode 16 Wochen lang erfolgreich aufrechterhalten werden, ohne dass neue Saatkulturen hinzugefügt wurden. Die Experimente wurden alle 5 Tage pro Woche für den N−-Zustand mit Stickstoffverfügbarkeit für zwei Tage und anschließendem N-Mangel für drei Tage durchgeführt. Unter der N+-Bedingung wurden bis zum 5. Tag bis zu 20–60 % des anfänglichen Stickstoffs verbraucht (Abb. 2, ergänzende Abb. 1A). In N−-Teichen (R12, R13 und R16) war der Stickstoff am 3. Tag vollständig verbraucht und die Kulturen wurden bis zum 5. Tag unter N− gehalten (ergänzende Abbildung 1A). Es scheint, dass die Menge des N-Verbrauchs auch aufgrund anderer Umweltparameter variiert. Die Temperatur und die Sonneneinstrahlung variierten mit der Zeit, während das Experiment gegen Ende der 16 Wochen fortschritt. An Regentagen und zu Beginn des Winters wurde ein Rückgang der durchschnittlichen Sonneneinstrahlung und Temperatur beobachtet (Abb. 2). Dies spiegelte sich auch in den Korrelationsdaten zum Stickstoffverbrauch wider (ergänzende Abbildung 1B). Die N-Nutzung zeigte eine mäßig positive Korrelation zwischen Sonneneinstrahlung (r = 0,3) und Temperatur (r = 0,4). Darüber hinaus wurde auch eine mäßig positive Korrelation zwischen Sonneneinstrahlung und Temperatur beobachtet, während sie negativ mit der Zeit korrelierten.

Mittlerer N-Gehalt aus N-ausreichendem Zustand (N +), Tagestemperatur und Sonneneinstrahlung. Die schwarzen, grauen und gestrichelten Linien repräsentieren die Sonneneinstrahlung (MJ m−2 Tag−1), die tägliche Durchschnittstemperatur (°C) und den N-Gehalt (mg L−1) aus N+-Teichen.

Die Wachstumsrate im N−-Zustand war höher (23 %) als im N+-Zustand (Abb. 3a). Die wöchentlichen durchschnittlichen Wachstumsraten lagen zwischen 10 und 14 gm-2 d-1 im N−-Zustand und 6–12 gm-2 d-1 im N+-Zustand. Die durchschnittliche Wachstumsrate für die wöchentliche Kultivierung während des gesamten Experiments unter N+- und N−-Bedingungen betrug 8,9 ± 2,8 gm-2 d-1 bzw. 11 ± 3,3 gm-2 d-1. Aus der statistischen Analyse geht hervor, dass die Wachstumsratendaten von Tag 1 keinen signifikanten Unterschied zeigen und der p-Wert tendenziell im Laufe der Zeit von Tag 1 (G-DF: Wachstumsdatenrahmen, G-DF1) bis Tag 4 (G) abnimmt -DF2) (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 2A). Bis zum 5. Tag (G-DF3) kann ein signifikanter Unterschied in den Wachstumsraten zwischen den beiden Bedingungen beobachtet werden (Tabelle 1, ergänzende Abbildung 2B). Es gab deutliche Unterschiede in der Wachstumsleistung zwischen den Bedingungen (Ergänzende Abbildung 3A, B). Im Laufe von 4 Monaten war die Zellzahl im N+-Zustand zunächst höher als die im N−-Zustand, der Unterschied nahm jedoch mit der Zeit allmählich ab. In Woche 10 schien die Zellzahl unter beiden Bedingungen ähnlich zu sein (Abb. 3b, ergänzende Abb. 4A).

Wachstumsmerkmale von E. gracilis unter N-ausreichendem (N +) und N-Mangel (N−). (a) Vergleich der wöchentlichen durchschnittlichen Wachstumsraten zwischen N+ und N−. (b) Zellzahl und (c) Zelldurchmesser am Ende jeder Woche des wöchentlichen halbkontinuierlichen N−-Experiments. Leere Kreise zeigen Zellen an, die unter N−-Bedingungen gewachsen sind, und gefüllte Kreise zeigen Zellen an, die unter N+-Bedingungen gewachsen sind. Schwarze Sternchen kennzeichnen Zeiten mit geringer Wachstumsrate. Rote Sternchen kennzeichnen Wochen, in denen Zellzahl, Durchmesser und Paramylon nicht gemessen wurden. Fehlerbalken für jede Messung geben die Standardabweichung der Mittelwerte für jede Behandlung (N+ und N−) über drei Teiche (n = 3) an.

Der Zelldurchmesser hingegen unterschied sich deutlich in den Durchmesserdatenrahmen D-DF2 und D-DF3 (Tabelle 1). Der Zelldurchmesser im N−-Zustand war in den ersten Wochen ähnlich wie bei N+ und schien dann kleiner als der von N+-Zellen zu sein (Abb. 3c, ergänzende Abb. 4B). Das Muster der Veränderungen des Zelldurchmessers schien vom 3. bis zum 5. Tag jedes wöchentlichen Experiments zu variieren (ergänzende Abbildung 4B). Der Durchmesser der unter beiden Bedingungen (N+ und N–) gewachsenen Zellen korrelierte positiv miteinander (r = 0,7) und mit der Zeit (r = 0,3 bzw. r = 0,0), während er Woche für Woche im 14- Wochenexperiment (Ergänzende Abbildung 4C). Darüber hinaus korreliert der Zelldurchmesser der N+- und N−-Bedingungen negativ mit der Temperatur (r = − 0,4 bzw. r = − 0,1) und der Zeit, während er Tag für Tag innerhalb eines wöchentlichen Experiments fortschreitet (r = − 0,2 und r = −). 0,1) (Ergänzende Abbildung 4C).

Die Gesamtergebnisse deuten darauf hin, dass der Zelldurchmesser unter N−-Bedingungen im Vergleich zu den ersten Wochen leicht abnahm und vergleichsweise kleiner war als der N+-Zelldurchmesser. Dennoch betrugen die durchschnittliche Zellzahl (0,6 ± 0,1 × 106 für N+, 0,6 ± 0,0 × 106 Zellen mL−1 für N–) und der durchschnittliche Durchmesser (14,2 ± 0,7 µm für N+, 13,8 ± 0,6 µm für N–) während des gesamten Experiments im N+-Zustand höher als im N−-Zustand (ergänzende Abbildung 4D). Eine ähnliche Verringerung des Wachstums von E. gracilis wurde unter beiden Bedingungen beobachtet, wenn die Sonneneinstrahlung und die Temperatur niedrig waren (Abb. 2).

Die Studie untersuchte die Fluoreszenz und die Photosyntheseeffizienz von Chlorophyll (Chl) als Reaktion auf die Stickstoffverfügbarkeit. Die Ergebnisse zeigten, dass der Gesamtchlorophyllgehalt (Chl a + b) unter N−-Bedingungen etwas niedriger war als unter N+-Bedingungen (Abb. 1b, 4a). Allerdings waren die Chlorophyll-a (Chl-a)-Zusammensetzung und das Qy-Reaktionsmuster vor und nach der Dunkelinkubation unter beiden Bedingungen ähnlich (Abb. 4b – d). Darüber hinaus ergab die ANOVA-Analyse für alle vier Messungen keinen signifikanten Unterschied (p > 0,05) zwischen den beiden Bedingungen.

Chlorophyll und photosynthetische Aktivität von E. gracilis, gezüchtet unter N-ausreichenden (N +) und N-armen (N−) Bedingungen. (a) Gesamtgehalt an Chlorophyll (Chl) (Chl a + b), gemessen während der letzten Woche (Woche 16) der Kultivierung. (b) Prozentsatz (%) des vorhandenen Chlorophyll-a (Chl-a) am gesamten Chlorophyllgehalt. Photosynthetische Quantenausbeute (Qy), gemessen vor (c) und (d) nach 1-stündiger Inkubation im Dunkeln. Leere Kreise stellen die N−-Bedingung dar, und ausgefüllte Kreise stellen die N+-Bedingung dar. Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Mittelwerte für jede Behandlung (N+ und N−) über drei Teiche (n = 3) an.

Die Ergebnisse zeigten, dass der Paramylongehalt im N−-Zustand höher war als im N+-Zustand (Abb. 5a). Die Paramylon-Akkumulation lag im N−-Zustand zwischen 21,0 und 55,0 % des Trockenzellgewichts, während im N+-Zustand ein Wert zwischen 5,0 und 10,0 % beobachtet wurde. Unter N−-Bedingungen wurden durchschnittlich 41,0 ± 13,5 % (328,8 ± 182,9 pg Zelle-1) Paramylon akkumuliert, während unter N+-Bedingungen nur 7,7 ± 3,0 % (49,7 ± 23,3 pg Zelle-1) akkumuliert wurden. Die Ansammlung von Paramylon wurde auch unter dem Mikroskop als kleine körnige Körper in den Zellen beobachtet (Abb. 5b).

Paramylon und partikuläre Elementzusammensetzung. (a) Prozentsatz des gesamten Kohlenhydratgehalts, dargestellt als % Paramylon (Gew. % der trockenen Biomasse) in E. gracilis, kultiviert unter N-ausreichenden (N +) und N-armen (N−) Bedingungen. Der Paramylon-Gehalt wurde am letzten Tag jeder Woche des halbkontinuierlichen Kultivierungsversuchs gemessen, mit Ausnahme von Woche 6. Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Mittelwerte des Paramylon-Gehalts für jede Behandlung (N+ und N−) über drei Teiche an ( n = 3). (b) Mikroskopie von E. gracilis, gezüchtet unter N+- und N−-Bedingungen unter hellen und dunklen Feldern. Paramylon-Körper sind als kleine transparente oder rote ovale Körper in hellen bzw. dunklen Feldern zu erkennen. (c) Prozentsatz des gesamten organischen Kohlenstoffs (TOC) und Stickstoffs (TN), gemessen als Durchschnitt von drei wöchentlichen Proben, die aus einem Teich für jede Behandlung (N+ und N−) am letzten Tag jeder der drei Wochen entnommen wurden. Fehlerbalken geben die Standardabweichung der Mittelwerte der TOC- und TN-Messungen für jede Behandlung über den Zeitraum von drei Wochen an (n = 3). Graue Balken zeigen den N−-Zustand an und schwarze Balken zeigen den N+-Zustand an.

Es wurde auch festgestellt, dass sich der Gesamtstickstoffgehalt (TN) und der Gesamtkohlenstoffgehalt (TC) zwischen N−- und N+-Bedingungen unterscheiden (Abb. 5c). Am 5. Tag wurde in den Zellen unter der N+-Bedingung ein höherer Stickstoffgehalt (10,0 ± 0,5 %) im Vergleich zur N−-Bedingung (5,3 ± 1,2 %) beobachtet. Im Gegensatz dazu lag der durchschnittliche N-Gehalt im zellfreien Medium am Tag 5 unter der Nachweisgrenze von etwa 0 mg L−1 im N−-Zustand und 44,8 ± 13,6 mg L−1 im N+-Zustand, was auf ein höheres Verhältnis hinweist von Stickstoff in der Zelle zum Medium in N− im Vergleich zum N+-Zustand.

Am Ende des wöchentlichen Experiments wurde festgestellt, dass in den N+-Zellen fast 48,0 ± 2,0 % Kohlenstoff vorhanden waren, während in den N−-Zellen 46,0 ± 2,0 % vorhanden waren. Der Gesamtkohlenstoffgehalt pro Zelle betrug 0,4 ± 0,1 ng Zelle-1 im N−-Zustand und 0,3 ± 0,0 ng Zelle-1 im N+-Zustand. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Stickstoffverfügbarkeit die Ansammlung von Paramylon und die Zusammensetzung der Partikel in Zellen beeinflusst.

In dieser Studie beobachteten wir eine um 23 % höhere Wachstumsrate im N−-Zustand im Vergleich zum N+-Zustand, was nicht allein durch die Unterschiede in der Kohlenstofffixierung erklärt werden kann. Die zellulären Reaktionen variierten mit der Zeit. Aus den Ergebnissen ging klar hervor, dass die Zellen in beiden Bedingungen während der ersten drei Tage des Experiments unter N-ausreichenden Bedingungen aktiv wuchsen, mit ähnlichen anfänglichen Biomassekonzentrationen in allen Tanks. Daher wurden bei den G-DF1- und G-DF2-Tests keine signifikanten Unterschiede beobachtet. Allerdings zeigte die Wachstumsrate für alle Tage (G-DF3) einen deutlichen Kontrast zwischen N+- und N−-Bedingungen mit einem p-Wert von weniger als 0,05, was auf eine höhere Wachstumsrate unter N−-Bedingungen hinweist. Die durchschnittliche Zellgröße im N−-Zustand war ebenfalls kleiner als im N+-Zustand, was sich in den D-DF2- und D-DF3-Tests mit einem p-Wert von weniger als 0,05 widerspiegelte. Der Trend der Zellgröße steht im Einklang mit früheren Berichten für andere Algengattungen Scenedesmus und Rhodomonas sowie für Arten wie Ankistrodesmus falcatus und Stephanodiscus minululus19,35. Interessanterweise zeigte die Korrelationsanalyse, dass die Verringerung der Zellgröße während kurzer Kultivierungsperioden sowohl unter N+- als auch N−-Bedingungen auftrat, unter N−-Bedingungen jedoch offenbar stärker ausgeprägt war. Darüber hinaus können bei längeren Kultivierungsperioden Zellgröße und -zahl durch Umweltfaktoren beeinflusst werden, die über die Stickstoffverfügbarkeit hinausgehen, wie z. B. die Temperatur. In der aktuellen Studie wurde festgestellt, dass niedrige Umgebungstemperaturen unter beiden Bedingungen die Wachstumsrate verringern und das Zellvolumen erhöhen. Unsere Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die darauf hindeuten, dass E. gracilis das Protoplasmawachstum bei niedrigen Temperaturen und die Zellteilung bei hohen Temperaturen bevorzugt36. Der Einfluss der Temperatur auf die Zellgröße unter N−-Bedingungen scheint jedoch minimal zu sein und wurde bisher nicht berichtet. E. gracilis zeigte im N−-Zustand zunächst eine geringere Zellzahl und einen ähnlichen Durchmesser im Vergleich zum N+-Zustand, während nach einigen Wochen eine höhere Zellzahl mit kleinerem Durchmesser beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass eine längere Kultur unter halbkontinuierlichen N−-Bedingungen die Zellzahl moduliert Physiologie von E. gracilis. Unter N−-Bedingungen musste sich E. gracilis in kurzer Zeit an die Umgebung anpassen, in der die Stickstoffverfügbarkeit dramatisch schwankt. Die Zellen wachsen zunächst aufgrund einer ausreichenden N-Versorgung für 4 Tage schnell, bevor es zu einem 3-tägigen N-Mangel kommt, durchliefen jedoch später biochemische Veränderungen, um Energie zu speichern29. Es scheint, dass E. gracilis in der Lage ist, sich unter N−-Bedingungen an den zyklischen Prozess der N-Aufnahme zu gewöhnen, was zu einer höheren Wachstumsrate im Vergleich zu N+-Bedingungen führt. Da die Kultivierung in einem offenen Teich durchgeführt wurde, waren die Umweltbedingungen sowohl in N+- als auch in N−-Kulturen ähnlich, die beobachteten Unterschiede in Wachstum und Biomasse waren größtenteils auf die Stickstoffverfügbarkeit zurückzuführen.

Unter N−-Bedingungen kann eine kleinere Zellgröße auf einen geringeren Proteingehalt hinweisen19 und der Kohlenstoffpool ist auf die Synthese von Kohlenhydraten oder Lipiden ausgerichtet23,24,25. In unserer Studie beobachteten wir einen hohen Paramylongehalt (> 40 %) unter N−-Bedingungen, was darauf hindeutet, dass Kohlenstoff zur Energieeinsparung in Paramylon fixiert wird, was zu einer Erhöhung der Zelldichte führt. Andererseits nutzt E. gracilis unter N+-Bedingungen den fixierten Kohlenstoff, um Energie für die Zellteilung zu erzeugen, was zu hohen Zellzahlen, aber geringer Zelldichte führt. Dies zeigt sich an den Unterschieden in der Zellzahl und Biomasse zwischen den beiden Bedingungen in den ersten Wochen. Im Laufe der Zeit waren die Zellzahlen jedoch unter beiden Bedingungen ähnlich, während die Biomasse unter den N−-Bedingungen höher blieb. Dies unterstützt weiter die Idee der Akklimatisierung von E. gracilis, die es ihm ermöglicht, zu wachsen und gleichzeitig Paramylon anzusammeln, indem es den fixierten Kohlenstoff nutzt.

Darüber hinaus zeigen aktuelle Ergebnisse, dass der Kohlenstoffgehalt pro Zelle unter N−-Bedingungen (0,42 ng Zelle−1) fast 1,5-mal höher war als unter N+-Bedingungen (0,27 ng Zelle−1). Der beobachtete Anstieg des Kohlenstoffgehalts pro Zelle könnte wahrscheinlich auch auf eine erhöhte Kohlenstofffixierung durch Photosynthese zurückzuführen sein. Interessant ist, dass es trotz N-Mangel keine signifikanten Unterschiede im Gesamtchlorophyllgehalt gab. Die Grafik und die Farbe der N−-Kulturen lassen jedoch auf eine leichte Verringerung des Chlorophyllgehalts schließen. Normalerweise sinkt der Chlorophyllgehalt unter diesen Bedingungen aufgrund des bevorzugten Verlusts einiger Chloroplastenproteine ​​und schließlich des Ausgleichs des Photosyntheseprozesses37. Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied in der Quantenausbeute vor und nach der Inkubation im Dunkeln, daher kann gefolgert werden, dass sowohl N+- als auch N−-Kulturen bei der Umwandlung von Lichtenergie in chemische Energie während der Photosynthese gleichermaßen effizient sind. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass die N−-Kulturen eine höhere Wachstumsrate und Paramylonproduktion unterstützen können, was darauf hindeutet, dass der Photosyntheseapparat dieser Kulturen effizienter und an die Bewältigung von N-Mangel angepasst war. Es wurde zuvor die Hypothese aufgestellt, dass Mikroalgen unter N-Limitierungsbedingungen mit geringerer Pigmentierung eine hohe Photosyntheseeffizienz aufweisen38. Dies wurde auch bei Sonnenblumenpflanzen beobachtet, bei denen der maximale Quantenertrag durch N-Mangel nicht beeinflusst wurde39. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass in einigen Meeresalgen mehrere C-Fixierungswege (C3, C4 oder CAM) nebeneinander existieren40,41. Unter anderem spielt der CAM-Weg eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Photosynthese von Pflanzen unter Stressbedingungen und kann während der Nacht Kohlenstoff binden. Es wurde zuvor berichtet, dass Metaboliten im Zusammenhang mit dem CAM-Signalweg durch chemische Belastungen in E. gracilis stimuliert werden, was auf deren Existenz hinweist. Daher ist es möglich, dass die Aktivierung des CAM-Signalwegs bei längerem, halbkontinuierlichem N-Mangel zu einer aktiven Photosyntheseaktivität und einer erhöhten C-Fixierung in E. gracilis beiträgt.

Ähnliche Ergebnisse in Bezug auf Wachstum und Produktausbeute wurden in einer kürzlich durchgeführten Studie an einer Scenedesmus obliquus-Mutante (SO120G) unter N−-Bedingungen beobachtet33. Während der Chlorophyllgehalt in der aktuellen Studie nicht höher war als in der Kontrolle, anders als im Fall von SO120G33. Es zeigte sich, dass solche Reaktionen in SO120G auf die Hochregulierung von Genen zurückzuführen sind, die mit dem Cytochrom-b6/f-Komplex (Pet B) und dem photosynthetischen Elektronentransportträger (Pet J) zusammenhängen. Diese Proteine ​​vermitteln den Elektronentransfer vom Photosystem II zum Photosystem I und den zyklischen Elektronentransport und verbessern so die Photosyntheseeffizienz. In E. gracilis wurde petB wie bei Landpflanzen als Teil des Operonkomplexes petB-atpB-atpE im Chloroplastengenom identifiziert42. Die Aktivierung dieses Gens induziert auch die Expression des ATP-Synthase-Komplexes, der für die ATP-Synthese für die Zelle und die Produktbildung wesentlich ist. Es ist auch möglich, dass die leichte Reduzierung des Chl-Gehalts die Lichtdurchdringungseffizienz in die Kultur und damit die Produktbildung verbessert hat. In den ersten Stunden des Nährstoffmangels wird die Geschwindigkeit der Produktbildung schnell induziert, gefolgt von einem allmählichen Rückgang43. Dieses überschüssige Licht könnte die für die Produktbildung unter Stickstoffmangelbedingungen erforderliche Energie liefern44.

Im Gegensatz zu einem hohen Wachstum unter N−-Bedingungen ist eine geringere Wachstumsrate unter N+-Bedingungen ebenfalls ein wichtiges Ergebnis für das Verständnis der Biomasseproduktivität. Viele Mikroalgenarten bevorzugen Stickstoff in Form von Ammonium, und hohe Ammoniumkonzentrationen im Wachstumsmedium begünstigen die Aufnahme von NH4+-Ionen durch Algen. Dies führt jedoch auch zu einem übermäßigen NH4-Fluss, der die ATP-Bildung und die Regulierung der Photosynthese behindern kann45. Dies kann zu einer Ammoniumvergiftung führen, bei der die Umwandlungsrate von Ammonium in Aminosäuren langsamer ist als sein Einstrom in die Zellen, wodurch die Wachstumsrate unter N+-Bedingungen verringert wird46. Darüber hinaus geht damit ein Abfall des pH-Wertes einher, der die Effizienz der CO2-Fixierung durch die Algen verringert. In dieser Studie wurde der pH-Wert sowohl unter N+- als auch unter N−-Bedingungen konstant zwischen 2,3 und 2,5 gehalten und die Zellen schienen ein aktives Wachstum zu zeigen, was auf das Fehlen einer Ammoniumvergiftung hinweist.

Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass diese Kultivierungsmethode den Ertrag von E. gracilis verbessern kann. und ist ein wichtiger Gesichtspunkt für die Wirtschaftlichkeit der Algenkultivierung. Die Methode reduziert auch die Kosten für den Nährstoffeintrag. Darüber hinaus könnte der Anbau von E. gracilis mit dieser Technik in Kombination mit industriellen Nährstoffabfällen, anaeroben Gärresten organischer Abfälle und CO2-Abgasen aus Kraftwerken eine Kreislaufwirtschaft fördern und zu einer sauberen und nachhaltigen Umwelt beitragen9,47. Darüber hinaus kann dieser Ansatz auf andere Mikroalgen angewendet werden und eine nachhaltige Quelle für Biokraftstoffe und andere Bioprodukte darstellen.

Der Anbau im offenen Teich weist jedoch einige Einschränkungen auf9. Die Aufrechterhaltung eines stabilen ganzjährigen Anbausystems ist eine Herausforderung, da es von günstigen Wetterbedingungen wie warmen Temperaturen und ausreichend Sonnenlicht abhängt und daher auf bestimmte geografische Regionen beschränkt ist. In dieser Studie wurde eine Korrelation zwischen Wachstumsbedingungen wie Lichtintensität, Temperatur und Stickstoffverbrauch mit der Zeit beobachtet, was auf die Auswirkungen saisonaler Schwankungen hinweist. Offene Teichsysteme sind auch anfällig für eine Kontamination durch andere Mikroorganismen wie Bakterien und andere Algen, was häufige Kontaminationskontrollen erfordert. In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Kontamination nicht signifikant war, wenn der pH-Wert unter 2,5 gehalten wurde. Darüber hinaus können hohe Temperaturen in offenen Teichen zu Wasserverlusten durch Verdunstung führen, was zu einer verminderten Produktivität führt. Daher ist eine regelmäßige Überwachung und Wartung des Wasserstands in den Teichen notwendig, um eine optimale Produktivität sicherzustellen. Daher ist es trotz des Potenzials der offenen Teichkultur wichtig, diese Einschränkungen bei der Gestaltung eines Algenkultivierungssystems für die kommerzielle Produktion zu berücksichtigen.

Zusammenfassend hat diese Studie gezeigt, dass E. gracilis unter längeren N−-Bedingungen über einen ausgeprägten Anpassungsmechanismus verfügt, der zuvor nicht beobachtet wurde. Die Ergebnisse zeigten einen allmählichen Anstieg der Zellzahlen, eine geringere Zellgröße im Vergleich zu Kontrollbedingungen und eine unbeeinträchtigte photosynthetische Aktivität. Weitere Omics-Studien sind erforderlich, um die Regulierungsmechanismen zu verstehen, die zu diesen einzigartigen Beobachtungen beitragen. Die Ergebnisse dieser Studie haben vielversprechende Auswirkungen auf die industrielle Produktion von E. gracilis und Paramylon allein unter Verwendung des Wildtyp-Stammes. Es kann eine halbkontinuierliche, nährstoffarme offene Teichkultur eingeführt werden, die die Betriebskosten senken und gleichzeitig die Biomasse und den Produktertrag erhöhen würde.

Für das Experiment wurde E. gracilis verwendet, das bei Euglena Co., Ltd. (Tokio, Japan) gehalten wird. Alle Experimente, einschließlich der Saatgutskalierung, wurden unter Verwendung von Cramer-Myers-Medium (CM-Medium)1,28 mit Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) als Stickstoffquelle (N) bei einer Konzentration von 70 mg L−1 durchgeführt. Aus der Stammkultur wurden zunächst 2 L-Impfkulturen hergestellt und diese dann im Labor auf 30 L skaliert. Die Temperatur, Belüftung und Lichtintensität für die Impfkulturen wurden bei 30 °C, 0,01 vv−1 min−1 (10 % CO2) bzw. 800 μmol m−2 s−1 (kontinuierlich mit Leuchtstofflampen beleuchtet) gehalten. Diese Kultur wurde in offenen Teichen von 1 m2 auf 50 m2, 500 m2 und schließlich auf einen 1000 m2 großen Laufteich weiter ausgebaut. Jeder Scale-up-Schritt dauerte etwa 7 Tage. Vor dem Hauptexperiment wurde die 1000 m2 große Laufbahnkultur 4 Monate lang halbkontinuierlich mit wöchentlicher Zugabe von frischem CM-Medium aufrechterhalten.

Diese Studie wurde zwischen Juli 2022 und Oktober 2022 mit sechs 1 m2 großen Tanks durchgeführt: R11, R12, R13, R14, R15 und R16. Die Algenkulturen wurden halbkontinuierlich in einem wöchentlichen Zyklus gezüchtet, mit einer fünftägigen Versuchsphase, gefolgt von einer zweitägigen Erhaltungsphase, um ein ausreichendes Wachstum bis zum nächsten Zyklus zu ermöglichen. In drei Tanks (R11, R14 und R15) befanden sich die Kulturen unter Kontrollbedingungen mit ausreichenden Stickstoffgehalten (N+) und in den anderen drei in R12, R13 und R16 unter Stickstoffmangelbedingungen (N–) (Abb. 1). . Der N-Mangel-Kultivierungsprozess beinhaltete, dass die Kulturen jede Woche vom dritten bis zum fünften Tag N−-Bedingungen ausgesetzt wurden, während die restlichen Tage unter N+-Bedingungen gehalten wurden.

Zu Beginn jedes wöchentlichen Experiments (Tag 1) wurde die anfängliche Biomassekonzentration in jedem 1 m² großen Teich auf etwa 50 gm² eingestellt, gefolgt von der Zugabe des erforderlichen CM-Mediums ohne die N-Quelle. Anschließend wurden die Teiche bis zu einer Höhe von 200 mm über dem Boden mit Leitungswasser gefüllt (Gesamtvolumen 170 l). Für N+-Teiche wurde (NH4)2SO4 als N-Quelle in einer Konzentration von etwa 65 mg L−1 zugesetzt. Für N-Teiche wurde die anfängliche Ammonium-N-Konzentration auf 4–8 mg L-1 eingestellt und während der ersten beiden Tage jedes Zyklus über 2 mg L-1 gehalten. Nach den ersten zwei Tagen ist der N in der Kultur vollständig von den Zellen verbraucht und liegt unter der Nachweisgrenze (0 mg L−1). Die Teiche wurden dann für die nächsten 3 Tage unter N−-Bedingungen belassen. Am Tag 5 nach der Probenahme wurden 15–30 mg L−1 (NH4)2SO4 in die Stickstoffbecken gegeben, um die Ammonium-N-Konzentration zwei Tage lang bis zum nächsten Zyklus über 2 mg L−1 zu halten. Es ist von entscheidender Bedeutung, die (NH4)2SO4-Werte bis zum N-Mangelschritt zu überwachen und aufrechtzuerhalten, um zu verhindern, dass Zellen vor Beginn des Experiments einen Stickstoffmangel erleben. Die Wettervorhersage (Temperatur, Bewölkung und Niederschlag) wurde für die folgenden Tage genau überwacht und die erforderliche Menge an (NH4)2SO4 wurde entsprechend hinzugefügt, um bis zum dritten Tag einen N-Mangel in den N−-Teichen zu erreichen. Derselbe Zyklus wurde in der folgenden Woche wiederholt. Dieser Zyklus wurde wöchentlich bis Ende Oktober 2022 wiederholt. Darüber hinaus wurde die Durchmischung der Kultur aufrechterhalten, indem die beiden bestellten Schaufelräder mit 75 U/min betrieben wurden. Alle Teiche wurden mit 10 % CO2 mit einer Rate von 0,01 vv−1 min−1 belüftet und der pH-Wert wurde zwischen 2 und 2,5 gehalten.

Tägliche Probenahmen wurden um 17:00 Uhr durchgeführt, um die Biomasse (Trockenzellgewicht), die Zellzahl, die Größe und den NH4-N-Gehalt in allen Teichen zu messen. An jedem zweiten und letzten Tag des wöchentlichen Experiments wurden um 15:00 Uhr 1,5 l Kultur geerntet und zur Herstellung von Pulverproben gefriergetrocknet.

Zellphysiologie und Kontamination wurden täglich mit einem aufrechten Mikroskop OLYMPUS CX-41 bewertet. Zellzahl und -volumen wurden mit dem Sysmex-System-Partikelzähler CDA-1000 (Sysmex Corp., Hyogo, Japan) gemessen.

Glasfaserfilter (47 mm Durchmesser, Porengröße ADVANTEC, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokio, Japan) wurden 2 h (h) bei 100 °C in einem Ofen getrocknet und nach dem Abkühlen gewogen. Eine 10-Milliliter-Probe wurde durch einen Filter filtriert und dann dreimal mit 10 ml destilliertem Wasser (Dw) gespült (ODER gewaschen). (Alle Filtrationsschritte wurden mit sanfter Vakuumabsaugung durchgeführt.) Der Nassfilter wurde vor dem Wiegen 2 Stunden lang bei 100 °C getrocknet. Die Biomasseproduktivität wurde anhand der Wachstumsrate und der spezifischen Wachstumsrate gemessen, die wie folgt berechnet wurden;

Dabei ist DMi das Trockengewicht (OR-Masse) am Tag ti und v die Probenmenge (10 ml). Die Werte der Dreifachmessungen wurden gemittelt.

Die Paramylon-Konzentration wurde nach Ogawa et al. bestimmt. 201517. Die Beobachtungen wurden mit einem gitterbasierten Absorptionslesegerät SH-1300Lab (Corona Electric Co., Ltd., Ibaraki, Japan) gemessen.

Der tägliche Photonenfluss wurde mit einem Photonenfluss-Logger (Eko-Photon-Sensor ML-020P, EKO, Japan) aufgezeichnet, und die Wassertemperatur in den Teichen wurde mit einem Temperaturlogger (Thermo Recorder TR-52i, T&D Corporation, Japan) aufgezeichnet.

Die gesamte Chlorophyllextraktion erfolgte aus 1 ml E. gracilis-Kulturpellet unter Verwendung von 100 % Methanol [Toyama et al., 2019]. Für die Absorptionsmessung wurde das UVmini-1240-Spektrophotometer (Shimadzu Co. Ltd., Kyoto, Japan) verwendet. Der Gesamtgehalt an Chlorophyll (Chl a + b, µg mL−1) wurde wie folgt berechnet48;

wobei A665 und A650 die Absorption bei der Wellenlänge 665 nm bzw. 650 nm darstellen.

Um den Einfluss des semikontinuierlichen Nährstoffmangels auf die Photosyntheseaktivität zu verstehen, haben wir außerdem die Quantenausbeute (Qy oder Fv/Fm) gemessen. Die Photosyntheseeffizienz (Qy) wurde mit AquaPen E-AP 110-C (Environmental Measurement Japan, CO., LTD., Japan) gemessen. Aus jedem Teich wurden zwei frische Proben von jeweils 10 ml entnommen. Eine Probe wurde mit Aluminiumfolie umwickelt und vor der Qy-Messung 1 Stunde lang im Dunkeln aufbewahrt, während die andere Probe unmittelbar nach der Probenahme gemessen wurde. Sowohl der Chl-Gehalt als auch die Photosyntheseeffizienz wurden in den letzten zwei Wochen des gesamten Experiments gemessen.

Der Gesamtkohlenstoffgehalt (TC) und der Gesamtstickstoffgehalt (TN) wurden von Sumica Chemical Analysis Services Ltd., Japan, analysiert. Für die Messung wurden getrocknete E. gracilis-Proben verwendet, die am Tag 5 (letzter Tag der N−-Bedingung) aus drei aufeinanderfolgenden wöchentlichen Experimenten (Woche 1 bis 3) gesammelt wurden. Der Durchschnitt dieser Daten wurde als der maximal verfügbare C- und N-Gehalt angesehen, der am Ende jedes Zyklus in den Zellen verfügbar war. NH4-N im Medium wurde unter Verwendung des zellfreien Mediums aus 1 ml Zellsuspension gemessen. Die Probe wurde zunächst 1,5 Minuten lang bei 10.000 U/min mit einer Hochgeschwindigkeits-Minizentrifuge (GUSTO® HIGH-SPEED MINI CENTRIFUGE, HEA10050, ILLINOIS, USA) zentrifugiert und der erhaltene Überstand wurde zur Messung des NH4-N-Gehalts mit Digital Pack verwendet Test Multi SP: DPM-MTSP (Kyoritsu Chemical-Check Lab. Corporation, Japan).

Mit der Software R-studio Version 4.2.1 wurde eine statistische Analyse durchgeführt, um den Unterschied zwischen N−- und N+-Bedingungen zu ermitteln. Die Daten zur Wachstumsrate (G) und zum Durchmesser (D) wurden in drei verschiedene Gruppen unterteilt, die als Datenrahmen (DF) bezeichnet werden: DF1, DF2 und DF3. DF1 repräsentiert die Daten aller Wochen nur von Tag 1, DF2 repräsentiert Daten von den Tagen 3–5 und DF3 repräsentiert alle 5-Tages-Daten. Eine einfache ANOVA wurde jeweils für G-DF und D-DF sowie für den Chlorophyllgehalt und Qy durchgeführt. Der Signifikanzwert für alle Tests wurde auf 0,05 festgelegt. Für die Wachstumsrate wurde Tag 1 als Differenz zwischen Tag 2 und Tag 1 gemäß der Gleichung in (1) berechnet, ebenso für die Tage 3–5. Beim Zelldurchmesser stellen die Tage die tatsächliche Zeitachse dar. Darüber hinaus wurde auch eine Pearson-Korrelationsanalyse durchgeführt, um die Korrelationen zwischen Sonneneinstrahlung, Temperatur und Zeit (in Tagen und Wochen) mit Variablen wie N-Gehalt in Zellen, N+-Zelldurchmesser und N−-Zelldurchmesser zu untersuchen.

Alle Daten werden im Manuskript in Form von Abbildungen, Tabellen und ergänzenden Daten bereitgestellt.

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Diese Studie basiert auf Ergebnissen eines Projekts, das von der New Energy and Industrial Technology Development Organization (NEDO) der Regierung in Auftrag gegeben wurde. von Japan, Japan. Wir danken Mieko Oue, Akiko Nishimura und Yui Yamamoto für ihre technische Unterstützung. Wir danken auch Koji Yamada.

Algae Energy Technology Research Institute, 649-17 Nishiyama, Taki-cho, Taki-gun, Mie, 519-2171, Japan

Ranjith Kumar Bakku, Yoshimasa Yamamoto, Yu Inaba, Taro Hiranuma, Enrico Gianino, Lawi Amarianto, Waleed Mahrous und Hideyuki Suzuki

Euglena Co., Ltd., G-BASE Tamachi 2. und 3. Etage, 29.05.11, Shiba, Minato-ku, Tokio, 108-0014, Japan

Ranjith Kumar Bakku, Yoshimasa Yamamoto, Yu Inaba, Taro Hiranuma, Enrico Gianino, Lawi Amarianto, Waleed Mahrous, Hideyuki Suzuki und Kengo Suzuki

Labor für Mikroalgen-Produktionskontrolltechnologie, RIKEN 1-7-22, Suehiro, Tsurumi, Yokohama, Kanagawa, 230-0045, Japan

Kengo Suzuki

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RKB führte die Experimente, die Datenanalyse und das Verfassen von Manuskripten durch. Y. Y führte eine Paramylon-Analyse durch. IY, TH, EG, LA und WM unterstützten uns bei der Vorbereitung der Teiche, der elektrischen Einrichtung, der Probenahme und der Wartung der Teiche. HS und KS konzipierten und gestalteten Experimente. Alle Autoren haben gleichermaßen zum Verfassen und Korrekturlesen des Manuskripts beigetragen.

Korrespondenz mit Ranjith Kumar Bakku oder Hideyuki Suzuki.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bakku, RK, Yamamoto, Y., Inaba, Y. et al. Neue Erkenntnisse über den Laufbahnanbau von Euglena gracilis unter langfristigem, halbkontinuierlichem Stickstoffmangel. Sci Rep 13, 7123 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34164-1

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Eingegangen: 23. Dezember 2022

Angenommen: 25. April 2023

Veröffentlicht: 02. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34164-1

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