Blog

Nov 01, 2023

Aktivierung von HIF

Band „Zelltod und Krankheit“.

Cell Death & Disease Band 14, Artikelnummer: 339 (2023) Diesen Artikel zitieren

426 Zugriffe

Details zu den Metriken

Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor 1α (HIF-1α) besitzt als Hauptregulator adaptiver Reaktionen auf Hypoxie zwei Transkriptionsaktivierungsdomänen [TAD, N-terminal (NTAD) und C-terminal (CTAD)]. Obwohl die Rolle von HIF-1α-NTAD bei Nierenerkrankungen erkannt wurde, sind die genauen Auswirkungen von HIF-1α-CTAD bei Nierenerkrankungen kaum bekannt. Hier wurden zwei unabhängige Mausmodelle für Hypoxie-induzierte Nierenschäden unter Verwendung von HIF-1α-CTAD-Knockout-Mäusen (HIF-1α-CTAD-/-) erstellt. Darüber hinaus werden Hexokinase 2 (HK2) und der Mitophagie-Signalweg mithilfe genetischer bzw. pharmakologischer Methoden moduliert. Wir haben gezeigt, dass HIF-1α CTAD -/- die Nierenschädigung in zwei unabhängigen Mausmodellen einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung verschlimmerte, einschließlich einer durch Ischämie/Reperfusion verursachten Nierenschädigung und einer durch eine einseitige Harnleiterobstruktion verursachten Nephropathie. Mechanistisch fanden wir heraus, dass HIF-1α CTAD HK2 transkriptionell regulieren und anschließend die durch Hypoxie verursachte Tubulusverletzung lindern kann. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass ein HK2-Mangel durch Mitophagie-Hemmung zu schweren Nierenschäden beitrug, während die Mitophagie-Aktivierung unter Verwendung von Urolithin A bei HIF-1α-C-TAD-/-Mäusen erheblich vor einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung schützen konnte. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass der HIF-1α-CTAD-HK2-Signalweg einen neuartigen Mechanismus der Nierenreaktion auf Hypoxie darstellt, der eine vielversprechende Therapiestrategie für durch Hypoxie verursachte Nierenschäden darstellt.

Hypoxie, eine der häufigsten pathophysiologischen Erkrankungen, ist ein entscheidender Auslöser einer Vielzahl von Nierenerkrankungen [1, 2]. Obwohl überzeugende Beweise darauf hindeuten, dass der Schweregrad und die Dauer der Hypoxie die Nierenprognose bestimmen [2, 3], bleiben die genauen molekularen Reaktionen der Niere auf Hypoxie weitgehend rätselhaft.

Es ist bekannt, dass der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1) für die zelluläre Anpassung an Hypoxie essentiell ist [4], der durch posttranslationale Modifikationen durch mindestens zwei separate sauerstoffabhängige Mechanismen streng reguliert wird: Hydroxylierung von Prolinresten durch die Prolylhydroxylasedomäne (PHD) und Asparaginhydroxylierung durch den Faktor-hemmenden HIF-1 (FIH-1) [5]. Strukturbiologische Studien ergaben, dass HIF-1 als Master-Transkriptionsfaktor zwei Transkriptionsaktivierungsdomänen besitzt [TAD; N-terminal (NTAD) und C-terminal (CTAD)], die durch PHD bzw. FIH-1 reguliert werden [6]. Darüber hinaus haben überzeugende Studien gezeigt, dass NTAD und CTAD unterschiedliche Gene transkribieren und so ihre eigene Funktion erfüllen können [6, 7]. Obwohl die Rolle von HIF-1 bei einer Reihe von Nierenerkrankungen untersucht wurde, wie durch genetische und pharmakologische Modulation belegt, bleiben die getrennten Funktionen von CTAD und NTAD bei hypoxischen Nierenerkrankungen unklar.

Derzeit werden Personen mit Nierenanämie mit einem spezifischen PHD-Inhibitor behandelt, der die Funktion von HIF-1α NTAD stimuliert [8]. Interessanterweise haben präklinische Studien gezeigt, dass die durch den PHD-Inhibitor induzierte Aktivierung von HIF-1α NTAD vor akuter Nierenschädigung (AKI) und chronischer Nierenerkrankung schützt. Wu et al. [9] zeigten, dass die Aktivierung von HIF-1α NTAD die Nieren vor Ischämie/Hypoxie schützt. Inzwischen wurde bestätigt, dass die Aktivierung von HIF-1 NTAD renoprotektive Wirkungen auf die diabetische Nephropathie hat [10]. Diese Daten deuten stark darauf hin, dass HIF-1α NTAD eine schützende Wirkung gegen Nierenerkrankungen haben könnte. Die genaue Rolle von HIF-1α CTAD bei hypoxischen Nierenerkrankungen ist jedoch nicht genau geklärt.

Hier haben wir die HIF-1α-CTAD-Knockout-Mäuse (HIF-1α-CTAD-/-) etabliert, um die potenzielle pathophysiologische Funktion von HIF-1α-CTAD bei hypoxischen Nierenerkrankungen zu beurteilen. Interessanterweise haben wir gezeigt, dass HIF-1α CTAD vor einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung durch Hexokinase 2 (HK2)-vermittelte Mitophagie schützt. Unsere Ergebnisse stellen eine neue Perspektive auf die Hypoxie-Reaktionssignalisierung in der Niere dar, die eine vielversprechende Therapiestrategie für hypoxische Nierenschäden bietet.

Alle Tierversuche wurden gemäß den Standardrichtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der Ethikkommission der Southeast University genehmigt. HIF-1α-CTAD-/-Mäuse wurden mithilfe eines CRISPR/Cas9-basierten Ansatzes erzeugt. Das HIF-1α-Gen wurde durch homologe Rekombination bearbeitet. Kurz gesagt, Cas9-mRNA und -gRNA werden durch In-vitro-Transkription erhalten. Der homologe Rekombinationsvektor (Donorvektor) wurde mithilfe der In-Fusion-Klonierung konstruiert, die einen 3,0 kb 5'-homologen Arm und einen 3,0 kb 3'-homologen Arm enthält. Anschließend wurden die Cas9-mRNA, -gRNA und der Spendervektor mikroinjiziert in die befruchteten Eier von C57BL/6J-Mäusen, um Mäuse der F0-Generation zu erhalten. Schließlich wurden die Mäuse der F0-Generation, die durch Polymerasekettenreaktion (PCR)-Amplifikation und -Sequenzierung identifiziert wurden, mit normalen C57BL/6J-Mäusen gepaart, um die Mäuse der F1-Generation zu erhalten. Durch Kreuzung heterozygoter Elternlinien wurden homozygote und Wildtyp-Wurfgeschwister (WT) erhalten. Männliche Mäuse (6–8 Wochen alt, 20–22 g schwer) wurden für Experimente verwendet, und die Mausmodelle für renale Ischämie/Reperfusionsverletzung (I/R) und einseitige Harnleiterobstruktion (UUO)-Nephropathie wurden wie zuvor berichtet erstellt [11]. , 12]. Für die bilaterale I/R-Verletzung wurden beide Nierenstiele 35 Minuten lang mit Mikroaneurysma-Klemmen abgeklemmt. Bei Scheinoperationen wurden die gleichen chirurgischen Eingriffe durchgeführt, ohne dass die Nierenstiele abgeklemmt wurden. Die Körpertemperatur wurde während des gesamten Eingriffs mithilfe einer empfindlichen Rektalsonde zwischen 36,5 °C und 37,0 °C kontrolliert. Für UUO wurde der linke Harnleiter der Maus direkt unterhalb des Nierenbeckens abgebunden. Scheinmäuse wurden identischen chirurgischen Eingriffen unterzogen, mit der Ausnahme, dass der Harnleiter nicht abgebunden wurde. Mäuse wurden am ersten Tag nach der I/R-Verletzung oder am dritten Tag nach der UUO unter Vollnarkose eingeschläfert und ihre Nieren wurden entnommen.

Vor der Etablierung des I/R-Verletzungsmodells wurden die Mäuse an zwei aufeinanderfolgenden Tagen täglich einer oralen Verabreichung von Urolithin A (MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA) in einer Dosis von 50 mg/kg Körpergewicht unterzogen, um eine Mitophagie auszulösen. Für den lentiviralen Gentransfer wurden Lentiviren, die HK2 (Lv-HK2) oder Negativkontrolle (Lv-NC) exprimierten, von GenePharma (Shanghai, China) erhalten. Am dritten Tag, vor der I/R- oder UUO-Operation, wurde ein Lv-vermittelter Gentransfer in den Nieren von I/RI-Mäusen durch Schwanzveneninjektion (5 × 108 TU/Maus) durchgeführt. Die Mäuse wurden am ersten Tag nach I/RI oder am dritten Tag nach dem Abklemmen der Nierenstiele eingeschläfert. Anschließend wurden Serum und Nierengewebe entnommen.

Wir haben die Expressionsmuster von mRNA-Genen in der Nierenrinde nach einer I/R-Verletzung mithilfe von RNA-Sequenzierung charakterisiert. Die auf den Datenbanken Gene Ontology (GO) und Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) basierenden Signalweganalysen wurden verwendet, um die Funktion unterschiedlich exprimierter Gene vorherzusagen.

Nieren von 6 Wochen alten Mäusen wurden entnommen und ihre tubulären Epithelzellen (TECs) wurden für die Primärkultur mit etablierten Methoden isoliert [13]. Die TECs wurden in einer feuchten Atmosphäre aus 5 % CO2 und 95 % O2 bei 37 °C kultiviert. Um eine hypoxische Schädigung auszulösen, wurden die Zellen 12 Stunden lang unter hypoxischen Bedingungen (1 % O2, 94 % N2 und 5 % CO2) im glukosefreien Medium kultiviert. Nach der hypoxischen Behandlung wurden die Zellen 2 Stunden lang in ein normales Kulturmedium mit Sauerstoff zurückgebracht, um sie erneut mit Sauerstoff zu versorgen (Hypoxie/Reoxygenierung, H/R). Die Kontrollzellen wurden mit einem regulären Medium in einem regulären Inkubator (5 % CO2 und 21 % O2) inkubiert. Für die adenovirale (Ad) Transfektion wurden bis zu einer Konfluenz von 70 % gewachsene Zellen 24 Stunden lang mit Ad-NC oder Ad-CTAD, das die bHLH-PAS-Domäne enthielt, gemäß den Anweisungen des Herstellers transduziert und anschließend 24 Stunden lang H/R-Bedingungen ausgesetzt. Ad-NC wurde als Negativkontrolle verwendet.

Der Chromatin-Immunpräzipitationstest (ChIP) wurde mit dem Simple ChIP Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads, Nr. 9003, Cell Signaling Technology) gemäß den vorherigen Beschreibungen durchgeführt [12]. IP wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen HIF-1α (ab2185, Abcam) oder IgG als Negativkontrolle durchgeführt. PCR mit spezifischen Primern der Promotorregion von HK2 wurde verwendet, um die präzipitierten DNA-Fragmente nachzuweisen.

Die Plasmide, wie das pGL3-HRE-HK2-Luc-Luciferase-Reporterplasmid, HIF-1α (HIF-1α TAD, enthält NTAD und CTAD), HIF-1α NTAD und HIF-1α CTAD im pSD11-Vektor, wurden von GenePharma konstruiert ( Shanghai, China). HIF-1α NTAD-Gal4 und HIF-1α CTAD-Gal4 wurden konstruiert, indem die Sequenzen des Addgene-Plasmids Nr. 18955 wie zuvor beschrieben in das Rückgrat des Addgene-Plasmids Nr. 24887 eingefügt wurden [14]. Die entsprechenden Plasmide wurden mit Lipofectamine 3000 gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) in Zielzellen transfiziert. Wie bereits berichtet, wurden detaillierte Methoden für den Luciferase-Reporter-Assay entwickelt [12].

Die Nierenrinde wurde in ein Fixiermittel getaucht, das 2,5 % Glutaraldehyd und 4 % Paraformaldehyd enthielt. Die Probenhandhabung und -detektion wurde vom elektronenmikroskopischen Kernlabor der Southeast University (H-7650, Hitachi, Japan) durchgeführt. Die Mitophagie in TECs wurde quantifiziert.

Mitochondrien wurden unter Verwendung des Mitochondrien-Isolationskits (BioVision, Inc. CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Kurz gesagt, nach dem Waschen mit eiskaltem PBS wurden die Zellen 5 Minuten lang bei 600 g zentrifugiert und in 1 × Cytosol-Extraktionspuffer resuspendiert. Anschließend wurde die Homogenisierung 10 Minuten lang bei 4 °C und 1200 g zentrifugiert, um Kerne und intakte Zellen zu entfernen. Der gesammelte Überstand wurde 30 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 g zentrifugiert. Abschließend wurden die Pellets in 1× Cytosol-Extraktionspuffer resuspendiert und 30 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 g zentrifugiert, um Mitochondrien zu erhalten.

Die Gesamt-RNA wurde mit TRIzol (Takara, Japan) extrahiert, anschließend wurde die cDNA mit einem PrimeScript RT-Reagenzienkit (Takara) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Unter Verwendung eines ABI PRISM 7300 Echtzeit-PCR-Systems (Applied Biosystems, USA) wurde eine Echtzeit-PCR (RT-PCR) durchgeführt. Die relative mRNA-Expression wurde auf β-Actin normalisiert. Alle Primer für RT-PCR sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Für die immunhistochemische Färbung wurden die formalinfixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte der Niere nach der Antigengewinnung mit dem Antigengewinnungspuffer EDTA bei pH 9,0 und 15-minütigem Erhitzen auf 100 °C mit primären Antikörpern gegen Nierenschädigung molekular-1 inkubiert ( KIM-1, MA5–28211, Invitrogen), F4/80 (ab6640, Abcam, Cambridge, MA), HK2 (ab209847, Abcam), PTEN-induzierte mutmaßliche Kinase 1 (PINK1, ab23707, Abcam), Bcl-2 19- kDa-interagierendes Protein 3 (BNIP3, ab109362, Abcam) oder Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit I (ab14705, Abcam) untersucht und anschließend mit einem Streptavidin-Peroxidase-Nachweissystem (Maixin Biotech, Fuzhou, China) gemäß dem Protokoll des Herstellers analysiert. Als Meerrettichperoxidase (HRP)-spezifisches Substrat wurde Diaminobenzidin (Maixin) verwendet.

Für die Immunblot-Analyse wurden die Nierenrinde, primäre TECs oder Mitochondrien wie zuvor beschrieben vorbereitet [11]. Anti-HIF-1α (ab1, Abcam), Anti-HIF-1α-C-terminal (ab228649, Abcam), Anti-LC3 (ab192890, Abcam), Anti-p62 (ab109012, Abcam), Anti-HK2 (ab209847, Als Primärantikörper wurden Abcam), PINK1 (ab23707, Abcam), BNIP3 (ab109362, Abcam), Anti-COX IV (ab16056, Abcam) und Anti-β-Actin (AY0573, Abways, China) eingesetzt. Als Sekundärantikörper wurden Meerrettichperoxidase-konjugierte Anti-Kaninchen-Immunglobulin-G- (IgG) oder Anti-Maus-IgG-Antikörper (Abcam) eingesetzt. Zum Nachweis der Signale wurde ein ECL Plus-Reagenz verwendet (Thermo Fisher Scientific). Die als relative Proteinexpression ausgedrückten Intensitätswerte wurden auf β-Actin oder COX IV normalisiert.

Die Daten werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die Daten wurden mithilfe eines Student-t-Tests oder Mann-Whitney-U-Tests von SPSS Version 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) analysiert. Ein zweiseitiger p-Wert von <0,05 wurde als signifikant angesehen.

HIF-1α-C-TAD-/--Mäuse wurden erzeugt, um die pathophysiologische Funktion von HIF-1α-CTAD zu untersuchen (Abb. 1a). Eine schematische Darstellung des HIF-1α-CTAD-Knockouts ist in Abb. 1b dargestellt. Darüber hinaus wurde ein spezifischer Anti-HIF-1α-CTAD-Antikörper verwendet, um die Ergebnisse des HIF-1α-CTAD-Knockouts zu bestätigen (ergänzende Abbildung S1). Wir stellten fest, dass die Spiegel von Serumkreatinin (SCr) und Blutharnstoffstickstoff (BUN) bei HIF-1α-CTAD-/-Mäusen signifikant erhöht waren (Abb. 1c). In der Niere von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen war auch die Expression von KIM-1, einem Marker für Tubulusverletzungen, erhöht (Abb. 1d, e). Wie in Abb. 1f dargestellt, führte die bilaterale Nierenverletzung in der WT-Gruppe zu einer Zunahme von Nekrose und Ablösung von Tubuli, zur Ansammlung von Zelltrümmern und zur Bildung von Zylindern. wohingegen diese Verletzungsparameter in der HIF-1α-CTAD-/-Gruppe signifikant verschlimmert waren. Darüber hinaus waren die mRNA-Expressionen für Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β) und Monozyten-Chemoattraktivprotein-1 (MCP-1) bei diesen Mäusen hochreguliert (Abb. 1g). Gleichzeitig wurde eine stärkere Makrophageninfiltration in verletzten Nieren von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen beobachtet (Abb. 1h). Diese Daten zeigten, dass HIF-1α-CTAD-Knockout die Nierenschädigung bei ischämischem AKI verschlimmert.

eine Konstruktionsstrategie für HIF-1α CTAD-/-Maus. b Schematische Darstellung des vorgeschlagenen HIF-1α CTAD KO. c SCr- und BUN-Spiegel am Tag 1 nach 35 Minuten einer durch Ischämie/Reperfusion verursachten Nierenschädigung (I/RI) (n = 6). d Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse (qRT-PCR) der KIM-1-Expression. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). e Repräsentative Bilder der KIM-1-Färbung (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. f Repräsentative histologische Veränderungen (Periodsäure-Schiff-Färbung [PAS]) am ersten Tag nach 35 Minuten I/RI (links, n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Quantifizierung der tubulären Verletzung anhand der PAS-Färbung (rechts, n = 6). g mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (Monozyten-Chemoattraktionsprotein-1 [MCP-1], Tumornekrosefaktor-α [TNF-α] und Interleukin-1β [IL-1β]) in der I/R-verletzten Niere, bewertet durch qRT- PCR. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). H. Repräsentative F4/80-gefärbte Nierenschnitte von I/R-verletzten Mäusen (links). Maßstabsbalken, 50 µm. Die semiquantitative Population von F4/80+-Makrophagen, die die I/R-verletzte Niere infiltrieren (rechts). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen dargestellt. **p-Wert < 0,01 im Vergleich zu den WT-Mäusen (t-Test).

Die pathophysiologische Funktion von HIF-1α CTAD wurde in UUO, einem Modell für nicht reversible hypoxische Nierenschäden, weiter untersucht. Ähnlich wie beim I/RI-Modell beobachteten wir, dass die Expression von KIM-1 bei UUO-induzierter Nierenschädigung von HIF-1α CTAD–/– Mäusen signifikant erhöht war (Abb. 2a, b). Histologisch wurden in HIF-1α-CTAD-/--Nieren mit UUO schwere Nekrose und Ablösung von Tubuli, Ansammlung von Zelltrümmern und die Bildung von Zylindern beobachtet (Abb. 2c). Unterdessen war die Expression inflammatorischer Zytokin-mRNAs (MCP-1-, TNF-α- und IL-1β-mRNA) in den verstopften Nieren von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen signifikant erhöht (Abb. 2d). Parallel dazu wurde in dieser Gruppe auch ein signifikanter Anstieg der Makrophagenakkumulation beobachtet (Abb. 2e). Diese Ergebnisse zeigten somit, dass HIF-1α-CTAD-Knockout die Nierenschädigung in hypoxischen Nierenmodellen verstärkt.

eine qRT-PCR-Analyse der KIM-1-Expression. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). b Repräsentative Bilder der KIM-1-Expression in Nierengeweben von UUO-Mäusen wurden mittels Immunhistochemie beurteilt (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. c Histologische Veränderungen (PAS-Färbung) am Tag 3 nach UUO (links, n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Quantifizierung der tubulären Verletzung anhand der PAS-Färbung (rechts, n = 6). d mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (MCP-1, TNF-α und IL-1β) in der UUO-Niere, bewertet durch qRT-PCR. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). e Repräsentative F4/80-gefärbte Nierenschnitte von UUO-Mäusen (links). Maßstabsbalken, 50 µm. Die semiquantitative Population von F4/80+-Makrophagen, die die UUO-Niere infiltrieren (rechts). Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen dargestellt. **p-Wert < 0,01 im Vergleich zu den WT-Mäusen (t-Test).

Um die genauen Mechanismen möglicher schädlicher Auswirkungen zu untersuchen, die durch HIF-1α-CTAD-Knockout hervorgerufen werden, wurde eine genomweite Genexpressionsanalyse durchgeführt (Abb. 3a). Die hochregulierten und herunterregulierten Gene werden im Vulkandiagramm angezeigt (Abb. 3b). Um die inhärenten Transkriptommerkmale zu identifizieren und die Funktion unterschiedlich exprimierter Gene vorherzusagen, verwendeten wir GO- (Abb. 3c) und KEGG-Analysen (Abb. 3d) zur Merkmalsauswahl. Interessanterweise wurde festgestellt, dass die unterschiedlich exprimierten Gene mit der MAPK-Signalisierung, dem Metabolismus und der DNA-Replikation verbunden sind. Bei der Betrachtung der Transkriptionsfunktion von HIF-1 konzentrierten wir uns auf die unterschiedlich exprimierten Gene, die spezifisch herunterreguliert wurden.

a Die hierarchische Clusterbildung zeigt ein deutliches mRNA-Expressionsprofil zwischen den HIF-1α-CTAD-KO- und WT-Nieren mit I/RI. Die roten und grünen Farbtöne geben den Ausdruck über bzw. unter dem relativen Ausdruck über alle Proben hinweg an. b Vulkandiagramm, das unterschiedlich exprimierte Gene zeigt. Die hochregulierten Gene (rot) und die herunterregulierten Gene (grün) mit einer Fold Change <0,6 und mit p < 0,05. c Die Genontologie-Kategorienanalyse unterschiedlich exprimierter Gene. d Die Signalweganreicherungsanalyse unterschiedlich exprimierter Gene. e, f HK2-mRNA-Expression in der Niere mit I/RI (e) oder UUO (f), nachgewiesen durch qRT-PCR. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). g, h Western-Blot-Analyse der HK2-Expression in der Niere mit I/RI (g) oder UUO (h) (n = 6). i, j Immunhistochemische Analyse der HK2-Expression in der Niere mit I/RI (i) oder UUO (j) (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm für I/RI; 100 µm für UUO. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen dargestellt. **p-Wert < 0,01 im Vergleich zu den WT-Mäusen (t-Test).

Interessanterweise stellten wir fest, dass die Expression von HK2, einem essentiellen Enzym, das die Glykolysegeschwindigkeit begrenzt, in HIF-1α-CTAD-/-Mäusen offenbar deutlich herunterreguliert war (Abb. 3a). Daher wurden die Ergebnisse der genomweiten Sequenzierungsanalyse sowohl in vivo als auch in vitro validiert. Wir fanden heraus, dass die Expression von HK2 auf Transkriptionsebene in den Nieren von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen mit I/R (Abb. 3e) und UUO (Abb. 3f) signifikant verringert war. Inzwischen wurde seine Proteinexpression auch durch Western Blot bestätigt (Abb. 3g, h). Darüber hinaus ergab die immunhistochemische Analyse, dass HK2 vorwiegend in Tubuli exprimiert wurde, die HK2-Expression war jedoch in HIF-1α-CTAD-/-Mäusen mit I/R (Abb. 3i) und UUO (Abb. 3j) erheblich verringert. Diese Daten deuten darauf hin, dass HK2 an den durch HIF-1α CTAD vermittelten renoprotektiven Wirkungen beteiligt ist.

Da HK2 überwiegend in Tubuli exprimiert wurde, untersuchten wir anschließend seinen Regulationsmechanismus und seine Funktion in TECs. Wir beobachteten, dass die Expression von HK2-mRNA (Abb. 4a) und Protein (Abb. 4b und ergänzende Abb. S2a) in mit Hypoxie behandelten TECs von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen signifikant verringert war. Mittlerweile wurde auch ein deutlicher Anstieg der Expression von KIM-1 (einem empfindlichen und spezifischen Marker für Tubulusverletzungen) beobachtet (Abb. 4c). Noch interessanter ist, dass wir entdeckten, dass die Überexpression von HIF-1α CTAD die Expression von HK2-mRNA (Abb. 4d) und Protein (Abb. 4e und ergänzende Abb. S2b) in TECs signifikant induzierte. Wie erwartet nahm KIM-1 deutlich ab (Abb. 4f). Gleichzeitig wurde in dieser Gruppe eine verminderte Expression inflammatorischer Zytokin-mRNAs (MCP-1-, TNF-α- und IL-1β-mRNA) festgestellt (Abb. 4g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die durch HIF-1α-CTAD-Knockout induzierte HK2-Hemmung ein wichtiger Mechanismus für schwere Tubulusverletzungen sein könnte.

a, c qRT-PCR-Analyse der HK2- und KIM-1-Expression in den tubulären Zellen mit H/R. Der relative Spiegel wurde auf β-Actin normalisiert (n = 4). b Western-Blot-Analyse der HK2-Expression in den tubulären Zellen mit H/R (n = 4). d, f HK2- und KIM-1-mRNA-Expression wurden in primären TECs mit H/R analysiert, bevor HIF-1α CTAD mit Adenovirus (Ad-CTAD) überexprimiert wurde. Der relative Spiegel wurde auf β-Actin normalisiert (n = 4). e Western-Blot-Analyse der HK2-Expression in den primären TECs mit H/R, bevor HIF-1α-CTAD mit Adenovirus (Ad-CTAD) überexprimiert wurde (n = 4). g mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (MCP-1, TNF-α und IL-1β) in den primären TECs mit H/R, nachdem HIF-1α CTAD mit Adenovirus (Ad-CTAD) überexprimiert wurde. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 4). h Die Ergebnisse des Luciferase-Assays, korrigiert um die Transfektionseffizienz unter Verwendung von β-Galactosidase, werden als Durchschnitt aus 4 separaten Experimenten ± SEM angezeigt. Der ChIP-Assay zeigt die Bindung von HIF-1 an den HK2-Promotor (n = 4). j Die mRNA-Expression von KIM-1 wurde in primären TECs mit H/R analysiert, nachdem HK2 mit Adenovirus (Ad-HK2) überexprimiert wurde. Der relative Spiegel wurde auf β-Actin normalisiert (n = 4). k mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (MCP-1, TNF-α und IL-1β) in den primären TECs mit H/R, nachdem HK2 mit Adenovirus (Ad-HK2) überexprimiert wurde. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 4). **p-Wert < 0,01 gegenüber der NC-Gruppe (t-Test oder Mann-Whitney-U-Test).

Anschließend wurde der zugrunde liegende Mechanismus des durch HIF-1α-CTAD-Knockout induzierten Herunterregulierens von HK2 untersucht. Die In-silico-Analyse wurde verwendet, um zu bestimmen, ob HK2 direkt durch HIF-1 stimuliert wurde. Interessanterweise wurde die Existenz eines mutmaßlichen HIF-1-Bindungsmotivs (5′-RCGTG-3′) innerhalb der Promotorregion des HK2-Locus gefunden (Ergänzungsdatei 1), was darauf hinweist, dass HK2 möglicherweise durch HIF-1α transkriptionell reguliert wird. Laut dem Luciferase-Reporter-Assay induzierte HIF-1α-CTAD die HK2-Aktivität im Vergleich zu Kontrollen signifikant (Abb. 4h), was auf die Transkriptionsregulation von HK2 durch HIF-1α-CTAD hinweist. Um das Vorhandensein von HIF-1α CTAD in der Promotorregion von HK2 in vivo nachzuweisen, wurden ChIP-Assays durchgeführt. Wie erwartet stellten wir fest, dass die HIF-1α-CTAD-Bindung an diesem Promotor in den Nieren von WT-Mäusen angereichert werden konnte, nicht jedoch in den Nieren von HIF-1α-CTAD-/−-Mäusen (Abb. 4i), was die direkte Wechselwirkung zwischen HIF-1α-CTAD-Mäusen bestätigte. 1α und HK2 als Reaktion auf eine hypoxische Verletzung.

Anschließend wurde auch die mögliche Funktion von HK2 in hypoxischen TECs bestimmt. Das HK2 wurde unter Verwendung von Adenovirus-Vektoren überexprimiert. Interessanterweise wurde eine signifikant abnehmende Expression von KIM-1-mRNA (Abb. 4j) und Protein (ergänzende Abb. S3) beobachtet. Gleichzeitig wurde die Expression inflammatorischer Zytokin-mRNAs (MCP-1-, TNF-α- und IL-1β-mRNA) ebenfalls deutlich abgeschwächt, wenn HK2 überexprimiert wurde (Abb. 4k). Zusammengenommen spielt der HIF-1α-CTAD-HK2-Signalweg eine entscheidende Rolle beim Schutz vor durch Hypoxie verursachten Tubulusschäden.

Um die Rolle von HK2 bei I/R-induzierter Nierenschädigung unter den Bedingungen des HIF-1α-C-TAD-Knockouts zu verstehen, wurde eine HK2-Überexpression in HIF-1α-C-TAD-/-Mäusen mit I/RI unter Verwendung von Lv-HK2 durchgeführt Injektion. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die Mäuse, die die Lv-HK2-Injektion erhielten, erheblich reduzierte SCr- und BUN-Werte aufwiesen (Abb. 5a). Die Expression von KIM-1 war in den Nieren dieser Gruppe verringert (Abb. 5b und 5c). Mittlerweile zeigte auch die Perjodsäure-Schiff-Färbung (PAS) eine Besserung der Nierenschädigung (Abb. 5d). Darüber hinaus verringerte die Überexpression von HK2 die Expression von MCP-1-, TNF-α- und IL-1β-mRNAs in Nierenrindengeweben, wie durch Western Blot gezeigt (Abb. 5e). Darüber hinaus war, wie in Abb. 5f dargestellt, ein deutlicher Rückgang der Anzahl der Makrophageninfiltrationen zu verzeichnen. Diese Daten zeigten deutlich, dass eine Überexpression von HK2 unter Bedingungen eines HIF-1α-CTAD-Knockouts vor I/R-induzierter Nierenschädigung schützen könnte.

a Scr- und BUN-Spiegel in HIF-1α-CTAD-/-Mäusen, die nach der Verabreichung von Lv-HK2 35 Minuten lang I/RI ausgesetzt wurden (n = 6). b qRT-PCR-Analyse der KIM-1-Expression in HIF-1α-CTAD-/-Mäusen, die nach der Verabreichung von Lv-HK2 35 Minuten lang I/RI ausgesetzt wurden. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). c Repräsentative Bilder der KIM-1-Expression in Nierengeweben wurden mittels Immunhistochemie beurteilt (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. d Repräsentative histologische Veränderungen (PAS-Färbung) (links, n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Quantifizierung der tubulären Verletzung anhand der PAS-Färbung (rechts, n = 6). e mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (MCP-1, TNF-α und IL-1β) in Nierengeweben von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen, denen Lv-HK2 injiziert wurde (n = 6). F. Immunhistochemie und semiquantitative Population von F4/80+-Makrophagen, die die Nieren infiltrieren (n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. **p-Wert < 0,01 gegenüber Lv-NC. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen dargestellt. Als Kontrolle (t-Test) diente Lv-NC.

Die Funktion von HK2 wurde auch bei UUO-induzierter Nierenschädigung untersucht. Wie erwartet war die KIM-1-Expression in den Nieren von UUO-Mäusen mit HK2-Überexpression verringert (Abb. 6a, b). Die PAS-Färbung zeigte eine verbesserte Nierenschädigung (Abb. 6c). In der Zwischenzeit wurden die MCP-1-, TNF-α- und IL-1β-mRNA-Expressionen auch in renalen kortikalen Geweben von Mäusen mit HK2-Überexpression herunterreguliert (Abb. 6d). Darüber hinaus kam es, wie in Abb. 6e dargestellt, zu einer erheblichen Verringerung der Anzahl infiltrierender Makrophagen. Daher zeigten diese Daten, dass eine Überexpression von HK2 eine I/R-induzierte Nierenschädigung unter Bedingungen eines HIF-1α-CTAD-Knockouts verhindern könnte.

eine qRT-PCR-Analyse der KIM-1-Expression in der UUO-Niere von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen, denen Lv-HK2 injiziert wurde. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). B. Repräsentative Bilder der KIM-1-Expression in Nierengeweben wurden mittels Immunhistochemie beurteilt (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. c Repräsentative histologische Veränderungen (PAS-Färbung) (links, n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Quantifizierung der tubulären Verletzung anhand der PAS-Färbung (rechts, n = 6). d mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (MCP-1, TNF-α und IL-1β) in UUO-Nierengeweben von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen mit Lv-HK2-Verabreichung (n = 6). e Immunhistochemie und semiquantitative Population von F4/80+-Makrophagen, die die Nieren infiltrieren (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. **p-Wert < 0,01 gegenüber Lv-NC. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen dargestellt. Als Kontrolle (t-Test) diente Lv-NC.

Als nächstes wurde der Mechanismus der durch HK2-Mangel verursachten hypoxischen Nierenschädigung unter Bedingungen des HIF-1α-CTAD-Knockouts weiter untersucht. Da HK2 ein entscheidendes glykolytisches Enzym im Energiestoffwechsel ist, haben wir zunächst die wichtigen glykolytischen Metaboliten entdeckt. Interessanterweise stellten wir fest, dass es zwischen den beiden Gruppen keinen Unterschied im Laktat- und Pyruvatspiegel gab (ergänzende Abbildung S4). Eine aktuelle Studie hat herausgefunden, dass HK2 als Schlüsselregulator bei der Verknüpfung von Stoffwechsel und Autophagie fungiert. Daher schlugen wir vor, dass eine durch HK2-Mangel verursachte schwere hypoxische Nierenschädigung mit einer fehlerhaften Mitophagie verbunden sein könnte. Interessanterweise wurde eine signifikante Abnahme der LC3-II-Expression in der Nierenrinde von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen mit I/RI (Abb. 7a und ergänzende Abb. S5a) und UUO (Abb. 7b und ergänzende Abb. S5b) beobachtet ), was mit der erhöhten Expression von p62 übereinstimmte, einem Marker für eine beeinträchtigte Mitophagie. Unterdessen induzierte der HIF-1α-CTAD-Knockout im Vergleich zur WT-Gruppe verringerte Mengen an Autophagosomen und Autolysosomen in TECs sowie die Anzahl der Autophagosomen/Autolysosomen, die Mitochondrien umschließen, gemäß TEM-Analyse der Nierenrinde von Mäusen mit I/RI (Abb . 7c) und UUO (Abb. 7d). Parallel dazu wurde eine Verringerung der Expression der Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit I (Abb. 7e, f) und der enzymatischen Aktivität des mitochondrialen Atmungskettenkomplexes I beobachtet (ergänzende Abb. S6). Anschließend wurde mithilfe von Lentivirus-Vektoren die HK2-Expression stimuliert, um die mögliche Rolle von HK2 bei der Mitophagie-Regulation zu bestimmen. Interessanterweise wurde eine bemerkenswerte Abnahme der LC3-II-Expression und eine Zunahme der p62-Expression in der Nierenrinde abgeschwächt, die Lv-HK2 ausgesetzt war (ergänzende Abbildung S7). Wie erwartet wurden die Mitophagieveränderungen auch durch TEM bestätigt, wie in Abb. 7g, h dargestellt.

a, b Western-Blot-Analyse der LC3- und p62-Expression in der Niere mit I/RI oder UUO (n = 6). c, d Repräsentative TEM-Bilder von Mitochondrien in Nierentubuli von Mäusen mit I/RI oder UUO (n = 6). Maßstabsbalken, 1 µm. e, f Immunhistochemische Analyse der Expression der Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit I (MT-CO1) in Nierenschnitten (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. g, h Repräsentative TEM-Bilder von Mitochondrien in Nierentubuli von HIF-1α-CTAD-KO-Mäusen mit I/RI oder UUO nach Lv-HK2-Verabreichung (n = 6). Maßstabsbalken, 1 µm. i, j Repräsentative BNIP3-Bilder von Mitochondrien in Nierentubuli von Mäusen mit I/RI oder UUO (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm. k, l Repräsentative PINK1-Bilder von Mitochondrien in Nierentubuli von Mäusen mit I/RI oder UUO (n = 6). Maßstabsbalken, 50 µm für I/RI; 100 µm für UUO. Als Kontrolle diente die WT- oder Lv-NC-Gruppe.

Anschließend wurde der genaue Mechanismus der HK2-vermittelten Mitophagie untersucht. Es ist bekannt, dass die Mitophagie hauptsächlich über die Ubiquitin (Ub)-abhängigen (PINK1/parkin) oder Ub-unabhängigen (HIF-1/BNIP3) initiierenden Wege erreicht wird. Daher wurden in unserer Studie die beiden Wege entdeckt. Interessanterweise stellten wir fest, dass der Spiegel von BNIP3, einem direkt nachgeschalteten Ziel von HIF-1α, nicht beeinflusst wurde, wenn der HIF-1α-CTAD ausgeschaltet wurde (Abb. 7i, j). Allerdings war die Expression von PINK1 in den Nieren von HIF-1α CTAD–/– Mäusen mit I/RI (Abb. 7k) und UUO (Abb. 7l) signifikant verringert. Unterdessen wurden auch die Konzentrationen von PINK1 und BNIP3 in den Mitochondrien untersucht. Konsistent nahm der PINK1-Spiegel in Mitochondrien, die aus den Nieren von HIF-1α-CTAD-/-Mäusen mit I/RI und UUO isoliert wurden, signifikant ab, wohingegen der BNIP3-Spiegel unbeeinflusst blieb (ergänzende Abbildung S8). Um außerdem festzustellen, dass PINK1 durch HK2 reguliert wurde, wurde PINK1 erkannt, wenn HK2 überexprimiert war. Interessanterweise wurde ein signifikanter Anstieg der PINK1-Expression beobachtet (ergänzende Abbildung S9). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass eine durch HK2-Mangel induzierte Mitophagie-Hemmung eine durch Hypoxie verursachte Schädigung in TECs fördert.

Urolithin A (UA), ein spezifischer Mitophagie-Aktivator, der nachweislich die Gesundheit der Mitochondrien durch Stimulierung der Mitophagie beim Menschen verbessert [15], wurde zur Aktivierung der Mitophagie bei HIF-1α-CTAD−/−-Mäusen mit I/RI zur Bestätigung verwendet die funktionellen Auswirkungen der Mitophagie auf eine durch Hypoxie verursachte Nierenschädigung in vivo. Zunächst wurde die erfolgreiche Aktivierung der Mitophagie in tubulären Zellen bestätigt (ergänzende Abbildung S10). Wir fanden heraus, dass die Mäuse, denen UA verabreicht wurde, verringerte SCr- und BUN-Werte aufwiesen (Abb. 8a). Im Einklang mit der renalen Schutzwirkung wurde auch die verminderte Expression von KIM-1 beobachtet (Abb. 8b). Wie in Abb. 8c dargestellt, wurden die Nekrose und Ablösung von Tubuli, die Ansammlung von Zelltrümmern und die Bildung von Zylindern bei I/R-induzierter Nierenschädigung durch UA-Behandlung deutlich abgeschwächt. Darüber hinaus war bei diesen Mäusen auch die Expression inflammatorischer Zytokin-mRNAs (TNF-α, IL-1β und MCP-1-mRNA) herunterreguliert (Abb. 8d). Gleichzeitig wurde eine verringerte Makrophageninfiltration in verletzten Nieren beobachtet, die mit UA behandelt wurden (Abb. 8e). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung der Mitophagie eine durch Hypoxie verursachte Nierenschädigung unter den Bedingungen des HIF-1α-CTAD-Knockouts verhindert.

a SCr- und BUN-Spiegel in HIF-1α-CTAD-/-Mäusen, die 35 Minuten lang I/RI mit UA-Verabreichung ausgesetzt waren (n = 6). b qRT-PCR-Analyse der KIM-1-Expression. Die relativen Werte wurden auf β-Actin normalisiert (n = 6). c Repräsentative histologische Veränderungen (PAS-Färbung) (links, n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. Die Quantifizierung der tubulären Verletzung anhand der PAS-Färbung (rechts, n = 6). d mRNA-Expression von Entzündungsfaktoren (MCP-1, TNF-α und IL-1β) in Nierengeweben von mit UA behandelten HIF-1α-CTAD-/-Mäusen (n = 6). e Immunhistochemie und semiquantitative Population von F4/80+-Makrophagen, die die Nieren infiltrieren (n = 6). Maßstabsbalken, 100 µm. **p-Wert < 0,01 im Vergleich zum Fahrzeug. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM von 6 Mäusen dargestellt. Das Fahrzeug diente als Kontrolle (t-Test).

Obwohl HIF-1, ein Haupttranskriptionsfaktor für zelluläre Anpassungen an Hypoxie, eine entscheidende Rolle beim Schutz vor durch Hypoxie verursachten Nierenerkrankungen spielt [16], bleiben die genauen Auswirkungen von HIF-1α CTAD auf hypoxische Nierenerkrankungen unklar. In dieser Studie haben wir zunächst gezeigt, dass HIF-1α CTAD durch die Transkriptionsregulation von HK2 eine Schutzfunktion gegen durch Hypoxie verursachte Nierenerkrankungen ausüben kann. Darüber hinaus haben wir herausgefunden, dass der HIF-1α CTAD-HK2-Signalweg eine durch Hypoxie verursachte Nierenschädigung verhindert, indem er die PINK1-vermittelte Mitophagie aufrechterhält, einen bisher nicht erkannten Mechanismus für Reaktionen der Niere auf Hypoxie.

Hypoxie ist einer der wichtigsten Auslöser bei der Entstehung von Nierenerkrankungen und steht in engem Zusammenhang mit nachfolgender Nierenentzündung und Fibrose [1, 17]. HIF-1 wurde als Reaktion auf Hypoxie schnell aktiviert und bestimmte die Folgen einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung [18]. Noch interessanter ist, dass gezeigt wurde, dass die Aktivierung der tubulären HIF-1-Signalübertragung durch einen genetischen Ansatz oder pharmakologische Strategien renoprotektiv wirken könnte [19,20,21]. Zunehmende Studien ergaben jedoch, dass die HIF-1-Aktivierung pleiotrope Auswirkungen auf Nierenschäden und -reparaturen hat, indem sie Zielgene direkt reguliert [22]. Inzwischen hat unsere frühere Studie auch die zweiphasigen Wirkungen von HIF-1 auf Nierenerkrankungen gezeigt [23]. Kürzlich wurde erkannt, dass es eine physiologische Heterogenität im Signalweg von der Niere zur Hypoxie gibt, was zu einem neuen Verständnis von Nierenerkrankungen führen könnte [24]. Daher ist die Aufklärung der genauen Pathogenese von HIF bei hypoxischen Nierenerkrankungen von größter Bedeutung.

In einer früheren Studie haben Chowdhury et al. [25] schlugen vor, dass die Aktivierung verschiedener Domänen von HIF-1α die Funktionen von HIF-1 fein regulieren könnte. Strukturbiologische Studien haben gezeigt, dass HIF-1α über zwei Transkriptionsaktivierungsdomänen (NTAD und CTAD) verfügt, die verschiedene Gene transkribieren und dabei ihre eigenen Funktionen erfüllen können [6, 7, 26]. Kürzlich haben Ito et al. [27] wiesen darauf hin, dass die durch den PDH-Inhibitor induzierte Aktivierung von HIF-1α NTAD die Nieren durch eine Hochregulierung der Glykogenspeicherung vor Ischämie schützt. Die Funktionen von HIF-1α CTAD bei Nierenerkrankungen sind jedoch weiterhin ungewiss. In der vorliegenden Studie wurden die Funktionen von HIF-1α CTAD bei Hypoxie-induzierten Nierenerkrankungen unter Verwendung von HIF-1α CTAD-/−-Mäusen untersucht. Interessanterweise wurde festgestellt, dass HIF-1α CTAD−/− die Nierenschädigung in Mäusemodellen mit I/R- und UUO-induzierter Nierenschädigung verschlimmert. Darüber hinaus wurde die durch Hypoxie verursachte Nierenschädigung durch die Überexpression von HIF-1α CTAD signifikant abgeschwächt. Daher ist die Aktivierung von HIF-1α-CTAD eine der entscheidenden Reaktionen der Niere auf Hypoxie, und tubuläres HIF-1α-CTAD spielt eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung.

Es wurde zuvor von Baumann et al. [14] dass HIF-1α NTAD COL1A2 transkriptionell regulieren könnte, indem es an ein funktionelles, auf Hypoxie reagierendes Element in seinem Promotor bindet, um Glomerulosklerose zu fördern. Mittlerweile haben überzeugende Beweise gezeigt, dass HIF-CTAD-Knockout keinen Einfluss auf die HIF-abhängige Transkriptionsaktivierungsfunktion hat [28]. Daher nehmen wir an, dass HIF-1 CTAD eine renoprotektive Rolle bei Nierenerkrankungen spielt, indem es spezifische Zielgene transkribiert. Interessanterweise wurde beobachtet, dass HK2 in den HIF-1α-CTAD-/-Mäusen durch mRNA-Sequenzierung signifikant verringert war. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass HIF-1α CTAD die Transkriptionsreaktion von HK2 reguliert, was eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung spielt. Für unsere Ergebnisse relevant, Chan et al. [7] stellten außerdem fest, dass HK2 in hypoxischen Tumorzellen hauptsächlich durch HIF-1α-CTAD reguliert wird. Folglich könnte der HIF-1α-CTAD-HK2-Signalweg die entscheidende molekulare Reaktion der Niere auf eine hypoxische Schädigung sein. Unseres Wissens nach ist dies die erste Studie, die die Rolle von HIF-1α CTAD im Zusammenhang mit einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung charakterisiert und damit den Einblick in die Reaktionen der Niere auf Hypoxie erweitert.

Was ist dann der genaue Mechanismus, der der Verschlimmerung einer durch HK2-Mangel verursachten Nierenschädigung zugrunde liegt? In Anbetracht der Tatsache, dass HK2 das geschwindigkeitsbestimmende essentielle Enzym im glykolytischen Weg ist, das eine äußerst wichtige Rolle im Energiestoffwechsel spielt [29], stellten wir die Hypothese auf, dass die HK2-vermittelte Neuprogrammierung des Energiestoffwechsels der potenzielle präzise Mechanismus sein könnte, der HIF-1α CTAD-vermittelt zugrunde liegt Renoprotektion. Überraschenderweise stellten wir fest, dass ein HK2-Mangel aufgrund des HIF-1α-CTAD-Knockouts keine Veränderungen im Energiestoffwechsel verursachte. Frühere Studien legten nahe, dass HK2 Glykolyse und Autophagie integriert, um den Kardiomyozyten Zellschutz zu verleihen [30], und dass es für die Rekrutierung von Parkin in depolarisierten Mitochondrien erforderlich ist [31]. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die HIF-1α-CTAD-induzierte Renoprotektion durch Mitophagie vermittelt werden könnte, die für die Aufrechterhaltung der Nierenhomöostase von entscheidender Bedeutung ist [32]. Tatsächlich wurde bei HIF-1α-CTAD-/-Mäusen eine signifikante Verringerung der Mitophagie beobachtet. Inzwischen wurde der Befund durch die Gabe eines spezifischen Mitophagie-Aktivators bestätigt. Diese stimmten mit den Ergebnissen früherer Studien überein, wonach die Aktivierung der Mitophagie eine ischämische/hypoxische Nierenschädigung verhindert [33, 34]. Interessanterweise haben Tan et al. [35] fanden außerdem heraus, dass HK2 als Sensor zur Auslösung der Mitophagie in einem akuten Myokard-I/R-Modell fungieren könnte. Somit wird gezeigt, dass die durch HK2-Mangel vermittelte Hemmung der Mitophagie der entscheidende Mechanismus bei der durch HIF-1α-CTAD-Knockout verursachten Nierenschädigung ist.

Insbesondere wird HK2 zusätzlich zu seiner grundlegenden Rolle im Energiestoffwechsel, insbesondere der Glykolyse, zunehmend als Bestandteil eines Überlebenssignalnetzwerks erkannt [36]. Hier fanden wir heraus, dass die HK2-vermittelte Mitophagie eine durch Hypoxie verursachte Nierenschädigung lindert, was darauf hindeutet, dass HK2 während der Pathophysiologie hypoxischer Nierenerkrankungen durch die Integration von Energiestoffwechsel und Mitophagie zellulären Schutz verleiht. Es bleibt jedoch unklar, was den Wechsel zwischen der glykolytischen und der autophagischen Wirkung von HK2 auslöst. Einige Hinweise zeigten, dass Kinase-totes HK2 in endogenen HK2-depletierten Zellen die Autophagie in Gegenwart von Glukose stimuliert [37], was darauf hindeutet, dass die autophagische Wirkung von HK2 durch seine katalytische Aktivität unterdrückt wird. Es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um den genauen Mechanismus zu bestimmen.

Trotz der erheblichen Bemühungen vieler engagierter Forscher und Ärzte müssen die genauen molekularen Reaktionen von HIF-1 auf Hypoxie bei Nierenerkrankungen noch geklärt werden. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass tubuläres HIF-1α-CTAD eine durch Hypoxie verursachte Nierenschädigung verhindert, indem es HK2 transkriptionell hochreguliert, was die Mitophagie verstärkt und anschließend eine entscheidende Rolle bei der Renoprotektion spielt (Abb. 9). Diese Ergebnisse legen einen neuen Einblick in die molekularen Mechanismen der Niere bei Hypoxie nahe, bereichern die Hypoxie-Reaktionssignale und könnten ein spannendes Interventionsziel für hypoxische Nierenschäden darstellen.

Bei einer durch Hypoxie verursachten Nierenschädigung verhindert tubuläres HIF-1α-CTAD eine Nierenschädigung, indem es die HK2-vermittelte Mitophagie aktiviert.

Die Autoren bestätigen, dass die Daten, die die Schlussfolgerungen des Papiers stützen, im Artikel und seinem Zusatzmaterial enthalten sind. Weitere Daten zu diesem Artikel sind beim entsprechenden Autor erhältlich.

Wang B, Li ZL, Zhang YL, Wen Y, Gao YM, Liu BC, et al. Hypoxie und chronische Nierenerkrankung. EBioMedizin. 2022;77:103942.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ullah MM, Basile DP. Rolle der Nierenhypoxie beim Fortschreiten von einer akuten Nierenschädigung zu einer chronischen Nierenerkrankung. Semin Nephrol. 2019;39:567–80.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schödel J, Ratcliffe PJ. Mechanismen der Hypoxie-Signalisierung: neue Implikationen für die Nephrologie. Nat Rev Nephrol. 2019;15:641–59.

Artikel PubMed Google Scholar

Lee P, Chandel NS, Simon MC. Zelluläre Anpassung an Hypoxie durch hypoxieinduzierbare Faktoren und darüber hinaus. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21:268–83.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li Z, You Q, Zhang X. Kleinmolekulare Modulatoren des Hypoxie-induzierbaren Faktorwegs: Entwicklung und therapeutische Anwendungen. J Med Chem. 2019;62:5725–49.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dayan F, Roux D, Brahimi-Horn MC, Pouyssegur J, Mazure NM. Der Sauerstoffsensorfaktor-hemmende Hypoxie-induzierbare Faktor 1 steuert die Expression verschiedener Gene durch den bifunktionalen Transkriptionscharakter des Hypoxie-induzierbaren Faktors 1alpha. Krebs Res. 2006;66:3688–98.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chan MC, Ilott NE, Schödel J, Sims D, Tumber A, Lippl K, et al. Optimierung der Transkriptionsreaktion auf Hypoxie durch Hemmung der Prolyl- und Asparaginylhydroxylasen des Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF). J Biol. Chem. 2016;291:20661–73.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Locatelli F, Vecchio LD. Die Suche nach dem perfekten Mittel zur Anämiebehandlung bei chronischer Nierenerkrankung. J Am Soc Nephrol. 2022;33:662–4.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu M, Chen W, Miao M, Jin Q, Zhang S, Bai M, et al. Das Anti-Anämie-Medikament FG4592 verzögert den Übergang von AKI zu CKD, indem es die Gefäßregeneration und die antioxidative Fähigkeit verbessert. Clin Sci (London). 2021;135:1707–26.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sugahara M, Tanaka S, Tanaka T, Saito H, Ishimoto Y, Wakashima T, et al. Der Prolyl-Hydroxylase-Domänen-Inhibitor schützt vor Stoffwechselstörungen und damit verbundenen Nierenerkrankungen bei adipösen Mäusen mit Typ-2-Diabetes. J Am Soc Nephrol. 2020;31:560–77.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang TT, Wang B, Wu M, Li ZL, Feng Y, Cao JY, et al. Extrazelluläres vesikelverkapseltes IL-10 als neuartige Nanotherapeutika gegen ischämische AKI. Sci Adv. 2020;6:eaaz0

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li ZL, Lv LL, Tang TT, Wang B, Feng Y, Zhou LT, et al. HIF-1α, das die exosomale microRNA-23a-Expression induziert, vermittelt die Wechselwirkung zwischen tubulären Epithelzellen und Makrophagen bei tubulointerstitiellen Entzündungen. Niere Int. 2019;95:388–404.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Luo C, Zhou S, Zhou Z, Liu Y, Yang L, Liu J, et al. Wnt9a fördert die Nierenfibrose, indem es die Zellalterung in tubulären Epithelzellen beschleunigt. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1238–56.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baumann B, Hayashida T, Liang X, Schnaper HW. Der durch Hypoxie induzierbare Faktor 1α fördert Glomerulosklerose und reguliert die COL1A2-Expression durch Wechselwirkungen mit Smad3. Niere Int. 2016;90:797–808.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreux PA, Blanco-Bose W, Ryu D, Burdet F, Ibberson M, Aebischer P, et al. Der Mitophagie-Aktivator Urolithin A ist sicher und induziert eine molekulare Signatur für eine verbesserte mitochondriale und zelluläre Gesundheit beim Menschen. Nat Metab. 2019;1:595–603.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kapitsinou PP, Haase VH. Molekulare Mechanismen der ischämischen Präkonditionierung in der Niere. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;309:F821–834.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heyman SN, Gorelik Y, Zorbavel D, Rosenberger C, Abassi Z, Rosen S, et al. Beinahe-Ertrinken: Neue Perspektiven für die hypoxische akute Nierenschädigung des Menschen. Nephrol-Zifferblatt-Transplantation. 2020;35:206–12.

CAS PubMed Google Scholar

Li ZL, Wang B, Wen Y, Wu QL, Lv LL, Liu BC. Störung der Hypoxie-Reaktion und ihre Auswirkungen auf Nierenerkrankungen. Antioxid-Redox-Signal. 2022;37:936–55.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Weidemann A, Bernhardt WM, Klanke B, Daniel C, Buchholz B, Campean V, et al. Die HIF-Aktivierung schützt vor akuten Nierenschäden. J Am Soc Nephrol. 2008;19:486–94.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schley G, Klanke B, Schödel J, Forstreuter F, Shukla D, Kurtz A, et al. Die Stabilisierung der durch Hypoxie induzierbaren Transkriptionsfaktoren im dicken aufsteigenden Glied schützt vor einer ischämischen akuten Nierenschädigung. J Am Soc Nephrol. 2011;22:2004–15.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hill P, Shukla D, Tran MG, Aragones J, Cook HT, Carmeliet P, et al. Die Hemmung von Hypoxie-induzierbaren Faktor-Hydroxylasen schützt vor Nierenischämie-Reperfusionsschäden. J Am Soc Nephrol. 2008;19:39–46.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Maxwell PH, Eckardt KU. HIF-Prolylhydroxylase-Inhibitoren zur Behandlung von Nierenanämie und darüber hinaus. Nat Rev Nephrol. 2016;12:157–68.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li ZL, Lv LL, Wang B, Tang TT, Feng Y, Cao JY, et al. Die profibrotischen Wirkungen von MK-8617 auf die tubulointerstitielle Fibrose, vermittelt durch den KLF5-Regulationsweg. FASEB J. 2019;33:12630–43.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Scholz H, Boivin FJ, Schmidt-Ott KM, Bachmann S, Eckardt KU, Scholl UI, et al. Nierenphysiologie und Anfälligkeit für akute Nierenschäden: Auswirkungen auf die Renoprotektion. Nat Rev Nephrol. 2021;17:335–49.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chowdhury R, ​​Leung IK, Tian YM, Abboud MI, Ge W, Domene C, et al. Strukturelle Grundlage für die Selektivität der Sauerstoffabbaudomäne der HIF-Prolylhydroxylasen. Nat Commun. 2016;7:12673.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tal R, Shaish A, Bangio L, Peled M, Breitbart E, Harats D. Die Aktivierung der C-Transaktivierungsdomäne ist für optimale HIF-1-alpha-vermittelte transkriptionelle und angiogene Wirkungen wesentlich. Microvasc Res. 2008;76:1–6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ito M, Tanaka T, Ishii T, Wakashima T, Fukui K, Nangaku M. Die Hemmung der Prolylhydroxylase schützt die Nieren vor Ischämie durch Hochregulierung der Glykogenspeicherung. Niere Int. 2020;97:687–701.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yan Q, Bartz S, Mao M, Li L, Kaelin WG Jr. Die N-terminalen und C-terminalen Transaktivierungsdomänen des Hypoxie-induzierbaren Faktors 2alpha wirken zusammen, um die Nierentumorentstehung in vivo zu fördern. Mol Zellbiol. 2007;27:2092–102.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lan R, Geng H, Singha PK, Saikumar P, Bottinger EP, Weinberg JM, et al. Mitochondriale Pathologie und glykolytische Verschiebung während der Atrophie der proximalen Tubuli nach ischämischem AKI. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3356–67.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan VP, Miyamoto S. HK2/Hexokinase-II integriert Glykolyse und Autophagie, um Zellschutz zu verleihen. Autophagie. 2015;11:963–4.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

McCoy MK, Kaganovich A, Rudenko IN, Ding J, Cookson MR. Für die Rekrutierung von Parkin in depolarisierten Mitochondrien ist Hexokinaseaktivität erforderlich. Hum Mol Genet. 2014;23:145–56.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tang C, Livingston MJ, Liu Z, Dong Z. Autophagie bei Nierenhomöostase und -erkrankungen. Nat Rev Nephrol. 2020;16:489–508.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang C, Han H, Yan M, Zhu S, Liu J, Liu Z, et al. Der PINK1-PRKN/PARK2-Weg der Mitophagie wird aktiviert, um vor Schäden durch renale Ischämie und Reperfusion zu schützen. Autophagie. 2018;14:880–97.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang C, Han H, Liu Z, Liu Y, Yin L, Cai J, et al. Die Aktivierung der BNIP3-vermittelten Mitophagie schützt vor Schäden durch renale Ischämie und Reperfusion. Zelltod-Dis. 2019;10:677.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tan VP, Smith JM, Tu M, Yu JD, Ding EY, Miyamoto S. Die Dissoziation von mitochondrialem HK-II löst Mitophagie aus und verleiht Kardioprotektion gegen Ischämie. Zelltod-Dis. 2019;10:730.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Roberts DJ, Miyamoto S. Hexokinase II integriert Energiestoffwechsel und Zellschutz: Wirkt auf Mitochondrien und TORCing auf Autophagie. Zelltod ist unterschiedlich. 2015;22:248–57.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Roberts DJ, Tan-Sah VP, Ding EY, Smith JM, Miyamoto S. Hexokinase-II reguliert positiv die durch Glukosemangel verursachte Autophagie durch TORC1-Hemmung. Mol Zelle. 2014;53:521–33.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (82000648) unterstützt; das Schlüsselprogramm der National Natural Science Foundation of China (82030024 und 82230022); die Natural Science Foundation der Provinz Jiangsu (BK20200363), die Outstanding Youth Cultivation Foundation der Southeast University (2021ZDYYYQPY07), die Innovative and Entrepreneurial Talent (Doctor) der Provinz Jiangsu, die Natural Science Foundation der Provinz Shandong (ZR2022MH161) und die Clinical Medicine + X Projekt des angegliederten Krankenhauses der Universität Qingdao (3390). Die entsprechenden Autoren bestätigen, dass sie die endgültige Verantwortung für die Entscheidung über die Einreichung zur Veröffentlichung tragen.

Institut für Nephrologie, Zhong Da Hospital, Southeast University School of Medicine, Nanjing, Jiangsu, China

Zuo-Lin Li, Yue Zhang, Yi-Lin Zhang, Wei-Jie Ni, Tao-Tao Tang, Gui-Hua Wang, Bin Wang, Lin-Li Lv, Qiu-Li Wu, Yi Wen und Bi-Cheng Liu

Abteilung für Nephrologie, angegliedertes Krankenhaus der Universität Qingdao, Qingdao, Shandong, China

Lin Ding & Rui-Xia Ma

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

ZLL, RXM und BCL konzipierten die Studie, führten Experimente durch, analysierten Daten und verfassten und redigierten die Arbeit; LD, YZ, YLZ, WJN und TTT führten Experimente durch und analysierten die Daten; und GHW, BW, LLL, QLW und YW analysierten Daten, erstellten die Zahlen und redigierten das Papier; Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Papiers zu.

Korrespondenz mit Rui-Xia Ma oder Bi-Cheng Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Herausgegeben von Professor Boris Schiwotowski

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Li, ZL., Ding, L., Ma, RX. et al. Die Aktivierung der C-terminalen Transaktivierungsdomäne von HIF-1α schützt vor Hypoxie-induzierter Nierenschädigung durch Hexokinase-2-vermittelte Mitophagie. Cell Death Dis 14, 339 (2023). https://doi.org/10.1038/s41419-023-05854-5

Zitat herunterladen

Eingegangen: 18. Dezember 2022

Überarbeitet: 07. April 2023

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 24. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-023-05854-5

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt